商 靖 李 永

(省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所)

李愛寧 賀 偉 郭利民 常聚普

(省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))) (河南省濮陽市林業(yè)科學(xué)院)

責(zé)任編輯:程 紅。

歐美楊(Populus ×euramericana)屬楊柳科(Salicaeeae)、楊屬(Populus)，在意大利、法國、瑞典、美國、加拿大、南斯拉夫、韓國等國家大量種植。該樹種生長迅速、用途廣泛，是木材工業(yè)和造紙工業(yè)的理想原料。近年來，歐美楊在中國的河南、山東等地也進(jìn)行了大面積栽培。然而，自從2005年，河南濮陽、山東菏澤等地發(fā)生了歐美楊潰瘍病，經(jīng)鑒定其病原菌為Lonsdalea quercina subsp.populi［1］，該病害為我國新的林木病害。目前該病菌僅在我國和匈牙利有報(bào)道［2］。中林46 楊(P.×euramericana‘zhonglin 46’)等歐美楊品種染病后產(chǎn)生大量傷流，損耗樹木養(yǎng)分，使樹木材積和其他可利用部分減少;同時(shí)，由于韌皮部局部壞死，造成病部枝干和頂梢枯死，嚴(yán)重影響樹木的健康生長，甚至造成死亡。因此，在病害尚未大面積流行前，通過快速、準(zhǔn)確的早期檢測、及時(shí)制定藥劑防治措施對(duì)降低初始菌源量、抑制或減慢病害的發(fā)展具有極其重要的意義。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得對(duì)病害的快速檢測成為可能，尤其是Realtime PCR 技術(shù)可以定量檢測植物病原菌，具有快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)和高通量等優(yōu)點(diǎn)，而且不受寄主癥狀的影響，近幾年在植物病原菌的分子檢測和定量分析中也得到了充分的應(yīng)用［3-5］。例如，Gachon等［6］、B?hm 等［7］、Mercado - Blanco 等［8］、潘娟娟等［9］、孫蕾等［10］都利用該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)病原菌在寄主植物內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的追蹤。目前，國內(nèi)外尚未見關(guān)于歐美楊潰瘍病早期定量監(jiān)測方法的報(bào)道。本研究應(yīng)用Real-time PCR 方法，定量測定歐美楊潰瘍病病原菌在侵染過程中的動(dòng)態(tài)數(shù)量變化，同時(shí)對(duì)病原菌侵染后在植物組織中的擴(kuò)展情況進(jìn)行組織病理學(xué)研究，旨在明確病菌的侵染方式，為歐美楊潰瘍病的早期診斷和防治決策提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌接種

歐美楊潰瘍病病原菌菌株Lonsdalea quercina N-5 -1 保存于北京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。中林46 楊2年生枝條由河南省濮陽市林業(yè)科學(xué)院提供。選擇健康的歐美楊枝條，用滅菌水洗凈，然后再用75%的酒精擦拭接種點(diǎn)b(圖1)，用滅菌小刀在接種點(diǎn)劃5 mm×5 mm 的十字形小口，注入107菌落·mL-1的菌懸液100 μL，用蘸有無菌水的脫脂棉塊覆蓋在接種點(diǎn)上保濕。對(duì)照接種無菌水。將接種后的枝條置于小桶中，用無菌水水培，置于光照培養(yǎng)箱(溫度30 ℃，相對(duì)濕度90%，每日光照14 h)中培養(yǎng)。

1.2 歐美楊接種枝條總DNA 的提取

將組織剪碎，在液氮冷凍下研磨成粉末狀。每100 mg 樣品中加入1 mL CTAB，100 μL 10% SDS，60℃溫育40～50 min。13 000 r·min-1離心10 min，取上清800 μL 于另一離心管中。加入等體積氯仿，13 000 r·min-1離心10 min，取上清400 μL 于另一離心管中。加入等體積異戊醇，4 ℃靜置20 min，13 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入800 μL 75%酒精，13 000 r·min-1離心3 min，棄液體，13 000 r·min-1離心3 min，棄液體。晾干至無酒精味，加入20～40 μL TE 溶液，-20 ℃保存。

1.3 歐美楊組織中病原菌DNA 的Real-time PCR定量分析

應(yīng)用特異性引物L(fēng)qfF/LqfR(另文發(fā)表)擴(kuò)增L.quercina DNA，使用ABI 7500 system (Applied Biosystem，Carlsbad，CA，USA)進(jìn)行Real-time PCR 擴(kuò)增。

從LB 液體培養(yǎng)的細(xì)菌中提取基因組DNA，用紫外分光光度計(jì)(Perkin Elmer，USA)測定DNA 質(zhì)量濃度后，10 倍梯度稀釋，進(jìn)行定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品中的DNA 質(zhì)量濃度。

使用SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒(Taraka，大連)，20 μL 實(shí)時(shí)定量PCR 體系為，10 μL SYBR?Premix Ex TaqTMII，10 μmol 引物L(fēng)qfF/LqfR各0.6 μL，0.4 μL ROX Reference Dye II (50 ×)，2.0 μL 模板DNA，6.4 μL ddH2O。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)條件為，95 ℃預(yù)熱30 s，(95 ℃5 s，60 ℃34 s)，40個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的退火步驟時(shí)，進(jìn)行熒光信號(hào)的采集。PCR 循環(huán)結(jié)束后，升溫至95 ℃，降溫至60℃，再以0.5 ℃/s 緩慢升溫至95 ℃，生成融解曲線。

1.4 接種后歐美楊組織中病原菌含量及擴(kuò)展規(guī)律的Real-time PCR 定量檢測

按照1.1 的方法接種歐美楊枝條(帶葉，長30 cm)，分別在接種后3、5、7、9、11、13、15、17 d 各采集4 個(gè)接種枝條及1 個(gè)對(duì)照。每個(gè)枝條采集a、b、c 3 個(gè)點(diǎn)(其中b 點(diǎn)為接種點(diǎn)，a、c 點(diǎn)未接種為取樣點(diǎn)，包含韌皮部和木質(zhì)部)及枝條上的葉部組織Y 點(diǎn)(圖1)樣品各100 mg，重復(fù)3 次，進(jìn)行總DNA 提取。使用時(shí)稀釋10 倍，用引物L(fēng)qfF/LqfR 進(jìn)行Real -time PCR 擴(kuò)增。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的方程式，計(jì)算歐美楊潰瘍病病原菌的帶菌量(反應(yīng)體系和條件同1.3)，并獲得接種植物組織內(nèi)潰瘍病病原菌DNA 隨時(shí)間變化的定量關(guān)系。

圖1 歐美楊植株采樣示意圖

1.5 病理學(xué)觀察

采樣方法同1.4，將采得的植物組織材料置于FAA 固定液中固定，木質(zhì)部置于V(酒精)∶ V(甘油)=1∶ 1 的溶液中固定，一周后用石蠟切片法和木材切片法制成永久切片，切片厚度為8～9 μm，再將切片粘到載玻片上進(jìn)行展片、染色，切片在光學(xué)顯微鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)，并拍照，調(diào)查不同采樣時(shí)間病原菌的存在狀態(tài)、分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將歐美楊潰瘍病病原菌14 ng DNA 進(jìn)行5 次10倍梯度稀釋，用引物L(fēng)qfF/LqfR 進(jìn)行Real - time PCR 分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，DNA 質(zhì)量濃度(y)與Ct值(x)之間呈高度的相關(guān)性(y = -3.300 0x +20.037 7，R2=0.990 0)(圖2a)。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為了確定歐美楊(中林46)DNA 是否影響L.quercina DNA 的定量分析，將14 ng L.quercina 基因組DNA 進(jìn)行5 次10 倍梯度稀釋，分別加入到含有14 ng 中林46 楊基因組DNA 的樣品中，使得病原菌DNA 和植物DNA 質(zhì)量濃度的比值從1∶ 1 變化到1∶ 100 000，用引物L(fēng)qfF/LqfR 對(duì)DNA 混合樣品進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果表明:L.quercina DNA 質(zhì)量濃度(y)與Ct值(x)之間呈高度的相關(guān)性(y =-3.310x+21.081，R2=0.990)(圖2b)。因此，即使在高濃度的中林46 楊DNA 存在的情況下，引物L(fēng)qfF/LqfR 仍具有較好的特異性和靈敏度，可用于L.quercina 侵染過程的定量PCR 分析。

2.2 病原菌存在狀態(tài)及動(dòng)態(tài)分布

應(yīng)用Real-time PCR 測定表明(表1)，采樣點(diǎn)a、c 和枝條上的樹葉中都沒有菌量的積累，接種點(diǎn)b處，病原菌在接種侵染3 d 后植株內(nèi)己有一定的菌量積累，但植株并未顯癥;接種5 d 后，病原菌數(shù)量明顯增加，植株開始顯癥;從第7 天開始，有黏液流出，病情逐漸加重;9～15 d，病原菌量逐漸達(dá)到峰值，13 d 后，進(jìn)入穩(wěn)定期;接種15 d 后，病原菌DNA質(zhì)量達(dá)到7.2 ng。

表1 歐美楊枝條接種L.quercina 后不同時(shí)間的種群數(shù)量

圖3 歐美楊與潰瘍病菌互作的組織病理學(xué)

2.3 感病歐美楊的組織病理學(xué)

從圖3a-e 可以看出，健康的歐美楊韌皮部組織切片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞壁薄，細(xì)胞內(nèi)部透明，細(xì)胞核清晰可見。木質(zhì)部組織的導(dǎo)管壁薄，導(dǎo)管形狀多為圓形或者卵圓形，薄壁細(xì)胞和射線細(xì)胞內(nèi)部透明，排列有序，細(xì)胞形狀規(guī)則。采樣點(diǎn)a 和c 處的組織切片與健康組織切片無區(qū)別，而接種點(diǎn)b 處的組織切片結(jié)果與健康組織相比發(fā)生了明顯的變化。

接種侵染3 d 后的歐美楊組織(圖3f)細(xì)胞壁增厚，染色后顏色比健康組織深，從植物組織結(jié)構(gòu)上看，該病原對(duì)植物尚未造成明顯的傷害。從接種后第5 天開始，在橫切面上(圖3g)可以清晰地觀察到韌皮部細(xì)胞內(nèi)有較多染色加深物質(zhì)(圖3h)，薄壁細(xì)胞中次之(圖3i)，并且在其中的細(xì)胞間隙也存在此類物質(zhì)。在縱切面(圖4a)上，可觀察到不規(guī)則細(xì)胞，有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生破裂。感病歐美楊靠近韌皮部的發(fā)病木質(zhì)部組織中導(dǎo)管壁、射線細(xì)胞壁增厚，部分導(dǎo)管內(nèi)有侵填體(圖4b)。接種9～17 d，在樹皮橫切面可以看到，韌皮部部分細(xì)胞解體，形成較大空腔，薄壁細(xì)胞次之(圖4c)。薄壁組織細(xì)胞中也出現(xiàn)了較多的染色加深物質(zhì)(圖4d)，從徑向切面可以看出，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞融合(圖4e)。從感病歐美楊木質(zhì)部組織三切面可以看出(圖4f -h)，導(dǎo)管和射線細(xì)胞內(nèi)侵填體數(shù)量增多，朝向心材方向組織健康(圖4i)，其它無明顯變化。

圖4 L.quercina 侵染后歐美楊組織病理學(xué)

3 結(jié)束語

盡管已經(jīng)有大量研究［11-15］將Real -time PCR應(yīng)用于其他植物病原菌侵染過程的檢驗(yàn)，但將其應(yīng)用于歐美楊潰瘍病發(fā)生初期的檢測尚屬首次，這為歐美楊潰瘍病的早期診斷提供了新的途徑與方法。

歐美楊潰瘍病病菌的侵染方式為局部侵染。病原菌侵染植物后，樹皮和木質(zhì)部組織都產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng)來阻止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展，如細(xì)胞壁增厚、產(chǎn)生侵填體等。同時(shí)，在接種后產(chǎn)生的病斑中，韌皮部細(xì)胞變色多于薄壁組織，說明病原菌主要集中在韌皮部，病斑以外的組織與健康組織相比沒有區(qū)別。在距離接種點(diǎn)10 cm 之外的皮層和葉片組織中未檢測到病原菌，說明病菌侵入后未進(jìn)入離接種點(diǎn)較遠(yuǎn)的皮層組織和葉片中;從木質(zhì)部橫斷面看，靠近韌皮部的淺層木質(zhì)部中有侵填體，而朝向心材的木質(zhì)部中無侵填體，表明病菌在侵染過程中，其擴(kuò)展僅僅局限在侵染點(diǎn)周圍較小的范圍內(nèi)。本試驗(yàn)只是在室內(nèi)接種枝條上進(jìn)行了研究，田間自然情況下病菌侵染方式是否與室內(nèi)接種枝條研究結(jié)果一致還有待進(jìn)一步研究。

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