王欣，關鋒

1. 江南大學，糖化學與生物技術教育部重點實驗室，無錫214122；

2. 江南大學生物工程學院，無錫 214122

神經粘附分子(Neural cell adhesion molecule,NCAM)是一種大量存在于細胞膜上的跨膜糖蛋白，含有5個IgG樣結構域和兩個FN3樣結構域(圖1A)，通過同源(NCAM-NCAM)或者異源結合機制增強細胞-細胞間的粘附作用，并可以促進突觸的生成與發(fā)生，改變突觸功效，有利于神經系統(tǒng)的形態(tài)塑造等[1]。NCAM包括NCAM-120、NCAM-140和NCAM-180 3種亞型，分子量分別為120kDa、140kDa、180kDa。其中，NCAM-120是GPI錨定蛋白；NCAM-140和NCAM-180是兩種跨膜蛋白(圖1A)。NCAM-140和NCAM-180主要在胚胎早期發(fā)育中起作用，引導神經元的遷移，在胚胎分化過程中，可以檢測到NCAM-120的表達上調[2]。NCAM的第3、4、5個IgG樣結構域上共有 6個 N-糖基化位點[3]，NCAM基因經轉錄后修飾在第5個IgG樣結構域的第5和第 6個糖鏈末端修飾大量的多聚唾液酸(Polysialic acid, PSA)，形成多聚唾液酸化的NCAM，即PSANCAM[4](圖 1：A，B)。

唾液酸(Sialic acid, Sia)是一種九碳糖，結構超過了 50種，其核心結構主要為酮基-脫氧壬酮糖酸(Kdn)、Neu、N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac或 NANA)和 N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc或 NANG)(圖2)。這些單體組成的線性碳水化合物即為 PSA，其鏈長聚合度(Degree of polymerization, DP)可達 2～400不等[5](圖1B)。帶有大量負電荷的PSA可以降低NCAM的粘附作用，同時提高細胞的運動能力。一方面，PSA通過控制NCAM的粘附能力在神經系統(tǒng)的形成與重建過程中起著重要的作用[6,7]；另一方面，PSA因其空間排列以及聚合度的不同導致其載體-糖脂或糖蛋白的結構差異，一定程度上決定了該糖脂或糖蛋白的功能發(fā)揮[8,9]。PSA-NCAM對細胞粘附能力、遷移能力、侵襲能力的作用報道較多，但PSA對NCAM的修飾作用進而影響細胞下游信號通路的作用仍具有潛在研究價值[10]。

圖1 NCAM亞型及PSA-NCAM結構示意圖

圖2 唾液酸的核心結構

1 PSA對糖蛋白的修飾及與細胞因子的結合

PSA對糖蛋白的修飾作用以及與小分子的結合作用會對細胞內信號通路的維持產生影響。

1.1 PSA對大分子糖蛋白的修飾

脊椎動物中有6種糖蛋白可以發(fā)生多聚唾液酸化修飾，分別是魚卵多唾液酸蛋白[11]、NCAM[12]、大鼠腦部鈉離子通道蛋白[12]、人乳 CD36[13]以及人淋巴細胞神經纖毛蛋白-2[14]，其中NCAM被認為是研究PSA的模式蛋白。PSA-NCAM富含于各種胚胎組織中，但在絕大多數(shù)成熟組織中NCAM缺乏PSA修飾。PSA在胚胎和成人腦中的功能尚不完全清楚。人的血小板可以表達無唾液酸修飾的糖蛋白CD36，而人和鼠的乳汁中表達多聚唾液酸化的CD36，說明多聚唾液酸對新生兒的發(fā)育和營養(yǎng)至關重要[13]。

1.2 PSA與細胞因子結合

Ono等[15]推測PSA可以通過與神經因子形成特殊的復合物而調節(jié)神經營養(yǎng)因子、神經遞質(Neurotransmitters)、細胞因子和生長因子等的活動。PSA不僅具有抑制黏附的作用(圖3A)，Ono等還通過“two-complex”模型提出了PSA可能存在的一種新功能，即PSA具有保留與釋放兩種性能(圖3B)：首先，PSA能夠結合例如腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、成纖維母細胞生長因子2(Fibroblast growth factor 2, FGF2)和神經遞質等神經活性分子；其次，PSA維持了這種復合物存在所需要的獨特微環(huán)境。同時，PSA也具備調節(jié)釋放這些分子的功能，但PSA與這幾種分子的互作形式不盡相同：BDNF與PSA形成復合物后可由 PSA釋放 BDNF而直接遷移至高親和力的受體，轉移至哪個受體取決于這兩個分子之間的親和力大小；FGF2與PSA-NCAM形成復合物后，F(xiàn)GF2要通過其他中間體，并不能直接遷移(間接遷移)至FGFR。在上述過程中PSA均參與了信號通路的調節(jié)。

圖 3 PSA新功能的可能機制(參考文獻[15]并修改)

2 腫瘤細胞中存在PSA再表達的現(xiàn)象

近期研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細胞表面表達多聚唾液酸化的糖鏈[16]，表明PSA與腫瘤細胞的粘附性、遷移性和侵襲性等密切相關[17]。在小細胞肺癌(Small cell lung cancer)、膠質瘤(Glioma)、甲狀腺上皮細胞腫瘤(Thyroid epithelial tumors)、卵巢粒細胞瘤(Ovarian granulosa)、胰腺癌(Pancreatic cancer)、腎母細胞瘤(Wilms’ tumor)和成神經母細胞瘤(Neuroblastoma)等多種惡性腫瘤的病例中，可以檢測到NCAM的表達，除了小細胞肺癌無明確報道外，其他幾種惡性腫瘤均伴有PSA-NCAM的表達[6,18～23]。此外，在胰腺癌病例中，正常的胰腺組織和癌癥組織中都有NCAM的表達，而PSA-NCAM只表達于惡性胰腺癌中，在胰島中并沒有被發(fā)現(xiàn)[23]，說明PSA-NCAM與一些惡性腫瘤的發(fā)展密切相關。Schreiber等[24]對12例人胰腺癌腫瘤細胞樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)PSA-NCAM與上皮細胞粘附分子E-cadherin的結合抑制了E-cadherin介導的細胞粘附，揭示PSANCAM可以直接影響E-cadherin的功能。

3 PSA及NCAM增強細胞的遷移與侵襲能力易化腫瘤細胞的擴散

細胞外基質(Extracellular matrix, ECM)構成復雜的網架結構，支持并連接組織，調節(jié)組織的發(fā)生和細胞的生理活動。細胞的遷移能力依賴于細胞對細胞外基質的粘附作用，Li等[25]驗證了PSA在這一過程中所發(fā)揮的作用。該研究小組以表達NCAM而不表達PSA的小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3為研究對象，發(fā)現(xiàn)轉染STX基因可以實現(xiàn)NIH-3T3細胞中NCAM 3種亞型的多聚唾液酸化；與對照組相比，PSA降低NCAM與細胞基質間的相互作用，與肝素(Heparin)粘附能力增強而與纖連蛋白(Fibronectin, FN)粘附能力減弱，同時增強了NIH-3T3細胞的遷移以及侵襲能力。此外，當唾液粘蛋白表面大量表達PSA后，易化了細胞從原發(fā)腫瘤的脫落，從而轉移形成新的病灶[26,27]。研究發(fā)現(xiàn)，PSA可以引起腫瘤細胞的擴散，NCAM也有類似引起腫瘤細胞擴散的作用。Colombo等[28]發(fā)現(xiàn)正常的卵巢細胞并不表達NCAM，而卵巢癌細胞卻隨著病程的加劇高表達NCAM，由此可見，NCAM可以刺激卵巢癌細胞的遷移與侵襲。

4 PSA與NCAM介導的細胞信號應答

4.1 NCAM或PSA-NCAM通過FGFR信號通路調節(jié)細胞增殖與粘附能力

FGFR屬于一類新的受體激酶家族，能與FGF和HS形成三元復合物，也可以與NCAM直接結合而引發(fā)一系列的信號傳導途徑，參與胚胎發(fā)育、血管形成、傷口愈合等一系列生理過程的調節(jié)[29]。研究表明，NCAM、PSA-NCAM、PSA分別參與FGFR信號通路以調節(jié)細胞的增殖與粘附[24,25,30,31]。

4.1.1 NCAM介導的FGFR信號通路

NCAM可以依賴FGFR家族方式激活神經突生長，并伴隨著各種級聯(lián)信號的激活。如酪氨酸激酶 p59fyn(Tyrosine kinase p59fyn)、黏著斑激酶(Focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)、磷脂酶(Phospholipase C)途徑(PLC-γ pathway)、Ras-絲裂原蛋白活化激酶(Ras-mitogen-activated protein kinase)途徑(p42/44 MAPK pathway)的激活等[32～34]。研究證實，NCAM主要通過調節(jié)β1-integrin介導的細胞基質粘著力來參與腫瘤的病變與淋巴結轉移[32,35]，而NCAM與FGFR結合不但可以影響FGF介導的信號通路，還對細胞增殖粘附能力起作用[36]。

4.1.2 PSA-NCAM介導的FGFR信號通路

雖然諸多文獻報道了NCAM通過FGFR信號通路調節(jié)細胞生長和增殖的作用，但PSA-NCAM在這一過程中的可能作用仍缺少進一步的證據。Ono等[15]在分別過表達 STX和 PST的 NIH-3T3細胞中，發(fā)現(xiàn)FGF2介導的細胞生長受到抑制。該研究小組通過非變性凝膠電泳、凝膠過濾層析和SPR(Surface plasmon resonance)技術驗證了FGF2可以與PSA結合，條件是PSA最小聚合度為17。與FGF2形成復合物的HS相比，PSA可以和FGF2形成更大、更復雜的FGF2低聚物，并同時與FGF受體相結合。以上結果說明，PSA- NCAM與FGF2的結合方式異于HS，它能直接與FGF2結合而參與FGF2-FGF受體信號通路的調節(jié)。在研究PSA與FGFR的作用時，該研究小組發(fā)現(xiàn)PSA不能與FGFR結合，說明PSA對FGF- FGFR信號通路的影響主要通過調節(jié) FGF2分子在細胞內的濃度水平來實現(xiàn)。

4.1.3 PSA介導的FGFR信號通路

研究發(fā)現(xiàn)，PSA也可以通過非依賴于NCAM的信號通路介導細胞粘附的調節(jié)。Li等[25]闡述了由 PSA介導的細胞粘附機制，發(fā)現(xiàn)轉染 STX的NIH-3T3細胞中FGFR、FAK、ERK1/2的磷酸化水平顯著提高；而p59fyn的磷酸化水平因ECM中成分而異：肝素可以增強 p59fyn的磷酸化水平，F(xiàn)N(Fibronectin)反之，而 VN(Vitronectin)對 p59fyn的磷酸化水平無影響。PSA介導的細胞遷移增加的現(xiàn)象可能是由于FGFR、FAK、ERK1/2的活化而引起，而PSA介導的細胞粘附可能與p59fyn的活化有關。

4.2 NCAM 在上皮間質轉化過程中通過非依賴于FGFR的信號通路調節(jié)細胞粘附

上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程被認為是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程。該過程中，細胞極性喪失，上皮細胞表型丟失，而獲得了間質細胞的表型[30,37,38]。

Lehembre等[31]研究了EMT過程中NCAM對下游信號通路的影響。EMT發(fā)生前，E-cadherin在細胞表面的表達量較高，此時只有少量的NCAM與FGFR和PLCγ形成復合物，F(xiàn)GFR發(fā)送NCAM依賴性的信號，激活Raf-激酶PKCβII，持續(xù)保持MAPK 的活性以及增強細胞的粘附(圖 4b)。當EMT發(fā)生后，E-cadherin發(fā)生功能性缺失，NCAM的表達量增加，同時一部分NCAM的表達重新定位于脂筏中，此時p59Fyn大量聚集并與NCAM結合，p59Fyn被磷酸化和激活，它的效應物FAK導致形成穩(wěn)定的 β1-integrin介導的黏著斑，致使細胞延展性和轉移性的增強(圖4c)。與NCAM介導的 FGFR的信號通路比較，由 FGF介導的非NCAM依賴性的 FGFR信號通路則是通過 FGFs激活PLCγ/PKCα和Ras/Raf/MAPK信號途徑積累FGFR，最終提高細胞的粘附和增殖能力(圖4a)。因此，EMT過程影響了 NCAM介導的信號轉導特性，這種信號通路轉變的認識將有利于人們進一步認識腫瘤惡變過程的分子機制。

圖4 基于NCAM亞細胞定位改變的分子機制(參考文獻[31]并修改)

4.3 PSA與小分子配體結合調節(jié)細胞信號通路影響細胞遷移與粘附能力

在PSA介導的細胞應答中，與PSA結合的配體較少，包括 BDNF[39]、組蛋白 H1(Histone H1)[40]、FGF2[15]等。Theis等[41]證明富含丙氨酸的豆蔻?；鞍准っ窩的作用底物(Myristoylated Alanine-rich C Kinase Substrate, MARCKS)也能作為配體直接與PSA相結合。MARCKS是蛋白激酶C(Protein Kinase C, PKC)的特異性底物蛋白，介導神經元表面信號與肌動蛋白的運動。在明確細胞信號轉導過程中，底物蛋白磷酸化是各種信使系統(tǒng)作用的最后通路，在PKC的作用下，MARCKS發(fā)生磷酸化反應，參與跨膜信息傳遞與腦組織的發(fā)育，還在細胞轉移、粘附、分泌，以及細胞的內攝、外放和吞噬中起作用。同時，PSA還有捕獲兒茶酚胺神經遞質的功能，包括多巴胺，可以通過多巴胺受體調節(jié)Akt信號通路[42]。

5 唾液酸轉移酶STX與PST的檢測可能成為臨床診斷的重要手段

研究表明，兩種多聚唾液酸轉移酶(Polysialyltransferases)—ST8SiaII(STX)和 ST8SiaIV(PST)催化NCAM多聚唾液酸鏈的形成[43]。STX和PST在蛋白水平上有59%的同源性[44]，二者可以在NCAM的第五和第六個糖基化位點上獨立合成 PSA，或者協(xié)同作用合成更長的 PSA鏈，其特性比較見表 1。PST基因與STX基因是獨立調控的，預示這兩種酶有著不同的生物學作用。但是，每一個唾液酸轉移酶在惡性腫瘤發(fā)展中的生物學作用尚未見報道。

Tanaka等[6]研究了 24例非小細胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer, NSCLC)病例，發(fā)現(xiàn)表達PSA的 NSCLC病例中，STX基因在 I期腫瘤中的表達(4.2%)明顯低于IV期腫瘤(85.7%)，說明STX基因在腫瘤組織中的表達與腫瘤的發(fā)展進程密切相關。在NSCLC腫瘤組織中，只有腫瘤發(fā)展至后期STX基因才表達，然而PST基因在所有病例和正常肺部組織中都有表達，說明STX基因在NSCLC腫瘤病變過程中起重要作用。因此，STX基因可能是肺癌治療的一個新目標，對臨床標記具有重要的意義。另外，PST的mRNA水平表達的顯著變化也在胰腺癌病例中得到證實：所有NCAM表達陽性的胰腺癌腫瘤細胞都表達STX和PST兩種基因[24]。PSA的表達與癌癥分級相關，PSA表達陽性的癌癥中病患的5年存活率較低。針對不同癌癥中STX和PST基因的表達差異，監(jiān)控病情發(fā)展以及開展預前預后的工作已經應用到臨床檢測中。在神經母細胞瘤和橫紋肌肉瘤病人的血清檢查中，如果 PSA含量過高，則預示著有癌轉移與惡變的傾向，而STX轉錄水平的檢測已經成為斷定病患是否患有轉移性神經母細胞瘤疾病的標志[45]。

表1 STX與PST的特性比較

6 展 望

PSA及PSA-NCAM的研究，不僅對人們了解癌癥發(fā)生與發(fā)展提供導向作用，更對臨床工作提供更多的借鑒和指導。PSA還與多種人類重大疾病相關，例如老年癡呆癥(Alzheimer’s Disease)、抑郁癥、帕金森綜合征和癲癇癥等。老年癡呆癥的標志為神經遞質系統(tǒng)失調與突觸丟失，可能存在某些特殊的神經化學類物質導致神經元退化以及突觸重塑缺陷，研究發(fā)現(xiàn)NCAM影響腦源性神經營養(yǎng)因子BDNF的濃度水平，進而影響老年癡呆癥的發(fā)生[46]。鑒于PSA與人類多種疾病的發(fā)生緊密相關，對 PSA以及PSA-NCAM的研究，尤其是PSA影響細胞多種下游信號通路的研究將成為熱點。PSA通過FGFR信號通路增強細胞增殖能力，但也有報道指出PSA干擾了FGFR介導的細胞增殖現(xiàn)象[15]。因此，PSA的繁雜空間構象以及不同鏈長的存在形式影響了其載體糖蛋白功能，使PSA在不同的細胞中行使了不同的作用。PSA不同作用的發(fā)揮很可能存在其他信號通路的影響，有待深入研究探討。

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