王延鵬, 程曦, 高彩霞, 邱金龍

1.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所植物細(xì)胞與染色體工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京100101;

2.中國科學(xué)院微生物研究所植物基因組學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101

普通小麥(Triticum aestivumL., 2n=42, AABBDD)是異源六倍體, 是世界上最重要的糧食作物之一, 為人類提供約20%的能量。由于其基因組龐大(17 Gb), 約為人類基因組的5倍, 并且80%～90%的基因都存在3個(gè)或多個(gè)拷貝, 因此利用傳統(tǒng)的正向或反向遺傳學(xué)手段來解析小麥基因功能以及作物的性狀改良都有很大的難度, 這使得小麥基因組研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他作物。隨著小麥基因組測序的逐步完成, 建立一種高效的反向遺傳學(xué)手段將成為小麥基因組功能解析和作物改良的關(guān)鍵?；蚓庉嫾夹g(shù)是目前突變或改造基因的最具潛力的技術(shù)體系, 特別是類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)和成簇規(guī)律間隔的回文重復(fù)序列及相關(guān)系統(tǒng)(CRISPR/Cas9 system), 具有效率高、特異性好以及高通量的特點(diǎn)。

在小麥里解析與其親緣關(guān)系較近物種中控制重要性狀基因的同源基因功能是反向遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容, 有助于對小麥中相應(yīng)性狀的遺傳改良。小麥和大麥具有較近的親緣關(guān)系, 白粉病是大麥和小麥主要的世界性病害, 嚴(yán)重的影響到他們的產(chǎn)量和品質(zhì)。大麥里由于MLO基因的功能缺失突變使其具有廣譜和持久的抗性, 這種抗性在生產(chǎn)上已成功應(yīng)用了30多年還沒有被打破。在小麥中也存在MLO基因,在小麥 A、B、D基因組上各有一個(gè)拷貝(TaMLO-A1,TaMLO-B1,TaMLO-D1), 它們與大麥的MLO基因具有很高的相似性。將TaMLO-B1轉(zhuǎn)入大麥MLO基因的突變體里, 可使其恢復(fù)對白粉病的感病性, 這說明MLO基因的功能在進(jìn)化過程中具有保守性。因此, 對小麥MLO等位基因的缺失突變有望產(chǎn)生廣譜抗白粉病的品種。

中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞課題組和中國科學(xué)院微生物研究所邱金龍課題組合作, 利用基因組編輯技術(shù)首次在六倍體小麥中對MLO基因的3個(gè)拷貝同時(shí)進(jìn)行了突變, 獲得了對白粉病具有廣譜抗性的小麥材料。該研究首先利用TALEN技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多個(gè)拷貝基因的同時(shí)突變,即根據(jù)小麥MLO基因3個(gè)拷貝的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對TALENs,發(fā)現(xiàn)TALEN誘導(dǎo)的突變可以穩(wěn)定遺傳到后代, 并符合孟德爾遺傳規(guī)律。突變體材料經(jīng)過一代或兩代自交, 獲得了MLO基因不同組合的純合突變體(tamlo-aa,tamlo-bb,tamlo-dd,tamlo-aabb,tamlo-aadd,tamlo-bbdd,tamlo-aabbdd)。通過小麥白粉菌接種實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)只有小麥A、B和D基因組上3個(gè)MLO基因拷貝同時(shí)突變的純合突變體tamlo-aabbdd表現(xiàn)出對白粉菌極為顯著的廣譜抗性, 而其他組合的純合突變體與野生型一樣對白粉病具有感病性(圖 1)。該結(jié)果表明小麥MLO基因的 3個(gè)拷貝在功能上存在冗余, 這也可能是到目前為止在自然條件下或利用傳統(tǒng)育種手段而沒有獲得小麥mlo抗病材料的主要原因。

圖1 TaMLO基因3個(gè)拷貝的純合突變體使小麥對白粉病表現(xiàn)出極為顯著的抗性

該研究還利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對小麥MLO基因的定向突變, 即針對MLO基因的單個(gè)拷貝設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9靶位點(diǎn), 原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植物中的結(jié)果表明突變只發(fā)生在A基因組上。這個(gè)結(jié)果表明, 在多倍體的小麥中, 利用基因編輯技術(shù)既可以同時(shí)突變多個(gè)拷貝,也可以特異地突變單個(gè)基因拷貝。此外, 該研究還利用基因組編輯系統(tǒng)引發(fā)的DNA自身修復(fù)途徑非同源末端連接(NHEJ)在小麥MLO位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了基因的定點(diǎn)插入, 插入的片段可以穩(wěn)定遺傳。

該研究首次在一個(gè)多倍體物種中證明可以對多個(gè)部分同源的基因同時(shí)并準(zhǔn)確地進(jìn)行編輯, 并展示了通過基因組編輯可以實(shí)現(xiàn)不同物種的育種信息資源共享。此外,創(chuàng)制的小麥mlo突變體具有持久、廣譜抗白粉病的優(yōu)點(diǎn),也將為小麥白粉病的抗病育種提供重要的起始材料。該工作為小麥基因功能的研究以及育種新材料或品種的創(chuàng)制提供了一個(gè)全新的思路和技術(shù)路線。研究結(jié)果于2014年7月20日在線發(fā)表在生物技術(shù)領(lǐng)域權(quán)威期刊《自然-生物技術(shù)》(Nature Biotechnology)雜志上(http://dx.doi.org/10.1038/nbt.2969)。Nature Biotechnology同期配發(fā)一篇“News and Views”, 對該研究及相關(guān)領(lǐng)域的進(jìn)展進(jìn)行全面評述。