顏 譚，祝旭龍，李建輝(綜述)，呂 毅(審校)

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安716000； 2.陜西省人民醫(yī)院腫瘤外科，西安 710068；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，西安 710061)

干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生為各種組織細胞的潛能。目前，雖然人們對干細胞誘導(dǎo)分化的研究日趨成熟，但在體外誘導(dǎo)干細胞向膽管上皮細胞分化方面還存在一些不足，其研究大都停留在細胞轉(zhuǎn)化層面，并未能深入到基因調(diào)控水平，且分化機制還不完全明確，有待于更進一步的研究?，F(xiàn)就誘導(dǎo)干細胞向膽管細胞及肝細胞誘導(dǎo)分化的研究進展予以綜述。

1 干細胞向膽管細胞分化潛能

干細胞種類繁多，其既能自我更新，又能被誘導(dǎo)分化[1]。不同種類的干細胞經(jīng)誘導(dǎo)刺激可向膽管上皮細胞分化[2]。肝前體細胞，如肝原細胞、肝卵原細胞可誘導(dǎo)分化為膽管上皮細胞，卵圓細胞被認(rèn)為是肝干細胞，這是因為它具有向肝細胞和膽管上皮細胞分化的雙潛能性，并在移植后能夠重建肝臟。李鑄等[3]發(fā)現(xiàn)，肝原細胞既可以向肝細胞分化又可以向膽管細胞分化，其分化方向主要取決于細胞的外在刺激因素。Chen等[4]從鼠肝中提取了成纖維樣肝前體細胞；而Malh?o等[5]發(fā)現(xiàn)，肝前體細胞具有向膽管上皮細胞分化的潛能。另外，Dollé等[6]根據(jù)肝內(nèi)細胞乙醛脫氫酶活性的高低分離肝原細胞，經(jīng)過誘導(dǎo)可以表達肝細胞及膽管上皮細胞標(biāo)志物。不同組織器官來源的間充質(zhì)干細胞可誘導(dǎo)分化為膽管上皮細胞。Manohar等[7]發(fā)現(xiàn)，在成年鼠膽囊提取到的間充質(zhì)干細胞，經(jīng)誘導(dǎo)分化后可表達膽管細胞的表面標(biāo)志物，并出現(xiàn)膽管樣結(jié)構(gòu)及囊性結(jié)構(gòu)。人工誘導(dǎo)的多能干細胞在適當(dāng)?shù)臈l件下可表達相應(yīng)的膽管上皮細胞標(biāo)志物。

2 干細胞向膽管上皮細胞誘導(dǎo)分化的條件

目前，在體外誘導(dǎo)干細胞向膽管上皮細胞分化的方案比較少。誘導(dǎo)干細胞向肝細胞分化時，可表現(xiàn)出膽管的一些標(biāo)志物，如角化蛋白19(cytokeratin-19，CK19)、γ谷酰胺轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transpeptidase，GGT)等；誘導(dǎo)干細胞向肝或膽管上皮細胞分化多采用化學(xué)藥物刺激、與組織或細胞共培養(yǎng)、條件培養(yǎng)液刺激等方式，現(xiàn)多采用條件培養(yǎng)液刺激[8]。不同種屬的干細胞誘導(dǎo)分化濃度可不同，向肝細胞轉(zhuǎn)化主要依靠肝細胞生長因子(hepatocyte growth factors，HGF)、成纖維生長因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GF)、抑瘤素等[9]，向膽管轉(zhuǎn)化時多采用HGF、表皮生長因子(epidermal growth factors，EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)等[10]，刺激21 d左右即可完成轉(zhuǎn)化。

2.1誘導(dǎo)分化刺激因子 目前所采用的刺激因子主要有HGF、TGF、FGF、EGF、角化生長因子，干細胞生長因子等；另外還可添加丙戊酸鈉、辛二酰苯胺異羥肟酸、曲古抑菌素、丁酸鈉等組蛋白去乙?；敢种苿蜻M行表觀修飾，在基因?qū)用嬲{(diào)控干細胞向肝或膽管細胞的誘導(dǎo)分化；添加抑瘤素、地塞米松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸等可促進肝或膽管細胞成熟。如采用丙戊酸鈉與酸性成纖維細胞生長因子聯(lián)合刺激胚胎干細胞方案[11]，亞油酸、地塞米松、維生素C、EGF、基膜、HGF、FGF4聯(lián)合刺激人、小鼠及大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞方案，EGF、HGF、FGF2、尼克酰胺、抑瘤素聯(lián)合刺激人脂肪組織間充質(zhì)干細胞方案等[12]。

2.2誘導(dǎo)分化刺激因子的水平 不同種屬的干細胞誘導(dǎo)方案不同。國內(nèi)最新發(fā)現(xiàn)，采用10 g/L HGF、10 g/L EGF可將SD大鼠的骨髓間充質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化為膽管上皮樣細胞，其是目前采用的刺激因子誘導(dǎo)分化方案中濃度最大的[13]。Zhou等[14]分四步將小鼠胚胎干細胞誘導(dǎo)分化成肝細胞或膽管細胞，肝祖細胞誘導(dǎo)分化成膽管樣細胞時，采用的是100 μg/L HGF、50 μg/L EGF，誘導(dǎo)分化2 d即可發(fā)現(xiàn)膽管樣結(jié)構(gòu)，并可持續(xù)存在5 d。Dong等[15]采用1 mmol/L的丙戊酸鈉及10 μg/L HGF將少數(shù)的胚胎干細胞誘導(dǎo)分化成肝祖細胞后，再采用10 μg/L HGF、10 μmol/L地塞米松誘導(dǎo)分化30 d即可見到膽管樣結(jié)構(gòu)，這可能是誘導(dǎo)干細胞向膽管細胞分化所采用的誘導(dǎo)因子濃度最小的一種刺激方案。

2.3誘導(dǎo)分化刺激因子步驟 干細胞向肝膽管細胞誘導(dǎo)分化的過程一般分為3個步驟：抑制干細胞增殖并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)向內(nèi)胚層、向肝原細胞及肝膽管細胞轉(zhuǎn)化，或按照胚胎發(fā)育過程，添加誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)干細胞逐步分化成肝細胞或膽管上皮細胞。Nakamura等[16]采用人多能干細胞經(jīng)向內(nèi)胚層誘導(dǎo)、肝原始細胞形成及分化成熟肝細胞或膽管細胞3個階段誘導(dǎo)分化，而后檢測到肝或膽管細胞表達的特異性標(biāo)志物，如α胎蛋白、白蛋白及細胞色素P450等；另外，在第二個階段如采用向膽管誘導(dǎo)分化方案，可以檢測到膽管標(biāo)志物。Roelandt等[17]將胚胎干細胞按胚胎細胞發(fā)育過程逐步添加激活素A、Wnt3α(經(jīng)Nodal/Crip通路和β聯(lián)蛋白通路促使干細胞向原條、內(nèi)胚層方向分化)、FGF(主要是由橫膈或心臟間充質(zhì)細胞分泌，促使原條、內(nèi)胚層向肝芽方向生長)、HGF及卵泡抑素(促使肝芽向成熟細胞生長)，而后檢測到成熟細胞的標(biāo)志物。Zhou等[11]先采用丁酸鈉抑制組蛋白去乙?；父蓴_干細胞DNA與組蛋白結(jié)合，促進基因轉(zhuǎn)錄，然后與FGF聯(lián)合刺激胚胎干細胞直接向肝樣細胞分化，并使其成熟，該過程僅需10 d左右即可檢測到成熟的肝細胞標(biāo)志物。

3 干細胞向膽管上皮細胞誘導(dǎo)分化的機制

膽管細胞的誘導(dǎo)分化機制還尚不明朗，通過對胚胎發(fā)育過程的研究發(fā)現(xiàn)，膽管細胞的分化過程主要與Wnt/β聯(lián)蛋白、Notch及TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)[18]。Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路在肝臟胚胎發(fā)育和控制肝母細胞分化方面起著關(guān)鍵作用。Notch信號通路參與調(diào)控膽管形態(tài)的發(fā)生和(或)膽管細胞存活，其也是膽汁網(wǎng)絡(luò)形態(tài)發(fā)生和增殖擴張所需的。TGF-β通路是最早發(fā)現(xiàn)的膽管細胞信號通路，其能促進膽管細胞分化和管狀結(jié)構(gòu)形成，在該分化過程中抑制TGF-β的細胞因子表達，可阻止干細胞向膽管細胞分化。

4 膽管細胞的鑒定

細胞的鑒定主要是通過細胞的形態(tài)和細胞表面標(biāo)志物，膽管上皮細胞的標(biāo)志物有：Y染色體性別決定區(qū)域9，骨橋蛋白、肝細胞核因子1β、整合素β4、CK7、CK19、GGT、神經(jīng)細胞黏附因子、人體上皮細胞抗原、糖蛋白34、小分子RNA等。其中，CK19及神經(jīng)細胞黏附分子的表達提示該細胞具有向膽管細胞分化的潛能，在細胞成熟前表達量達最高水平。Raynaud等[18]研究發(fā)現(xiàn)，一些微RNA(micro RNA，miRNA)如miRNA-38、miRNA-30a以及 miRNA-30c在膽管細胞中特異表達，可用于膽管上皮細胞的檢測；同時還發(fā)現(xiàn)抑制膽管形成的標(biāo)志：轉(zhuǎn)錄因子3、叉頭轉(zhuǎn)錄因子A1(forkhead box，F(xiàn)oxA1)、FoxA2、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein，C/EBPα)等，其中，轉(zhuǎn)錄因子3抑制膽管上皮細胞分化、促進肝細胞分化，F(xiàn)oxA1、FoxA2抑制膽管細胞增殖，C/EBPα通過抑制肝細胞核因子6和肝細胞核因子1的表達而抑制膽管分化，而且肝細胞核因子6與C/EBP間可能在調(diào)節(jié)膽管細胞分化方面存在上下調(diào)控或階段依賴性關(guān)系。

5 誘導(dǎo)分化的意義及問題

干細胞誘導(dǎo)分化成膽管細胞可用于慢性、退行性、炎性及自身免疫性膽管病的治療及研究[19]。危及生命的急性或慢性移植物抗宿主肝膽管疾病應(yīng)用常規(guī)治療無效時，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細胞卻能得到很好的治療效果，而且采用分化的干細胞在治療膽管疾病時會更穩(wěn)定、更安全。目前，干細胞向肝膽管細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化方式逐漸增多，且過程簡單化，已深入到基因調(diào)控層面，分化的條件、機制、通道逐步明確，轉(zhuǎn)化有效性和一致性不斷提高。但目前干細胞在向膽管上皮細胞誘導(dǎo)分化方面還存在一些技術(shù)性難題，需要做進一步的研究[20]。

6 小 結(jié)

干細胞來源豐富、取材方便，且容易被分離純化，更能被誘導(dǎo)分化。研究發(fā)現(xiàn)，多種干細胞可按照抑制細胞增殖并誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)向內(nèi)胚層、再向肝原細胞及肝膽管細胞轉(zhuǎn)化的步驟或按照胚胎發(fā)育過程逐步添加一定種類及適當(dāng)劑量的刺激因子，誘導(dǎo)其向膽管樣細胞分化并逐步表達膽管細胞的表面標(biāo)志物[14]。目前，分化的條件、過程不斷簡化，機制逐步明朗，而且在疾病的治療方面也取得了顯著的進展。

[1] Shafritz DA,Oertel M.Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(2):198-213.

[2] Maerckx C,Scheers I,Tondreau T,etal.Hepato-biliary profile of potential candidate liver progenitor cells from healthy rat liver[J].World J Gastroenterol,2012,18(27):3511-3519.

[3] 李鑄,李立,冉江華,等.大鼠肝卵圓細胞的增殖模型建立和體外分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2010,5(20):663-666.

[4] Chen Y,Zhou H,Sarver AL,etal.Hepatic differentiation of liver-derived progenitor cells and their characterization by microRNA analysis[J].Liver Transpl,2010,16(9):1086-1097.

[5] Malh?o F,Urbatzka R,Navas JM,etal.Cytological,immunocytochemical,ultrastructural and growth characterization of the rainbow trout liver cell line RTL-W1[J].Tissue Cell,2013,45(3):159-174.

[6] Dollé L,Best J,Empsen C,etal.Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice[J].Hepatolgy,2012,55(2):540-552.

[7] Manohar R,Komori J,Guzik L,etal.Identification and expansion of a unique stem cell population from adult mouse gallbladder[J].Hepatology,2011,54(5)：1830-1841.

[8] 王賓,程云霄,呂云霄,等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向肝細胞誘導(dǎo)分化研究[J].中華實驗外科雜志,2013,30(1):169-170.

[9] Lee JH,Lee KH,Kim MH,etal.Possibility of undifferentiated human thigh adipose stem cells differentiating into functional hepatocytes[J].Arch Plast Surg,2012,39(6):593-599.

[10] Burra P,Arcidiacono D,Bizzaro D,etal.Systemic administration of a novel human umbilical cord mesenchymal stem cells population accelerates the resolution of acute liver injury[J].BMC Gastroenterol,2012,12:88.

[11] Zhou M,Li P,Tan L,etal.Differentiation of mouse embryonic stem cells into hepatocytes induced by a combination of cytokines and sodium butyrate[J].J Cell Biochem,2010,109(3):606-614.

[12] Banas A,Yamamoto Y,Teratani T,etal.Stem cell Plasticity:learning from hepatogenic differentiation strategies[J].Dev Dyn,2007,236(12):3228-3241.

[13] 張誠,楊玉龍,林美舉,等.體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向膽管上皮樣細胞分化[J].中國組織工程研究,2013,17(1):17-22.

[14] Zhou QJ,Xiang LX,Shao JZ,etal.In vitro differentiation of hepatic progenitor cells from mouse embryonic stem cells induced by sodium butyrate[J].J Cell Biochem,2007,100(1):29-42.

[15] Dong XJ,Zhang GR,Zhou QJ,etal.Direct hepatic differentiation of mouse embryonic stem cells induced by valproic acid and cytokines[J].World J Gastroenterol,2009,15(41):5165-5175.

[16] Nakamura N,Saeki K,Mitsumoto M,etal.Feeder-free and serum-free production of hepatocytes,cholangiocytes,and their proliferating progenitors from human pluripotent stem cells:application to liver-specific functional and cytotoxic assays[J].Cell Reprogram,2012,14(2):171-185.

[17] Roelandt P,Sancho-Bru P,Pauwelyn K,etal.Differentiation of rat multipotent adult progenitor cells to functional hepatocyte-like cells by mimicking embryonic liver development[J].Nat Protoc,2010,5(7):1324-1336.

[18] Raynaud P,Carpentier R,Antoniou A,etal.Biliary differentiation and bile duct morphogenesis in development and disease[J].Int J Biochem Cell Biol,2011,43(2):245-256.

[19] Behbahan IS,Duan Y,Lam A,etal.New approaches in the differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells toward hepatocytes[J].Stem Cell Rev,2011,7(3):748-759.

[20] 徐勇,周家華.組織工程化膽管中管狀組織細胞培養(yǎng)及其與支架材料的相容性[J].江蘇醫(yī)藥,2011,37(1):12-15.