江勝林綜述，凌秀鳳，張軍強審校

0 引 言

蛋白質(zhì)一直在基因表達過程中起主要的調(diào)控作用，RNA處于不顯要地位。然而，后來人們發(fā)現(xiàn)原核生物中，RNA能通過堿基配對的方式抑制操縱子的表達。既之，又發(fā)現(xiàn)RNA還能在mRNA前體加工和蛋白質(zhì)合成過程中具有催化功能，于是使RNA在細胞中所具備的功能被進一步拓展開來。1993年線蟲的發(fā)育調(diào)控中的第1個microRNA(1in-4)被發(fā)現(xiàn)后，原來有很多既往看似不重要的非編碼RNA參與了生命活動過程［1］，為我們進一步探索生命的奧秘，打開了一扇新的通道［2］。

1 microRNAs合成和作用機制

microRNA基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和內(nèi)含子的剪接后，形成成熟的microRNA。microRNA經(jīng)典的生物合成途徑是microRNA經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ或者RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄形成具有帽子結(jié)構(gòu)(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(poly A)的原始microRNA(pri-microRNA)，pri-microRNA再經(jīng)核糖核酸酶ⅢDrosha(RNaseⅢDrosha)和其輔助因子Pasha/DGCR8(一種雙鏈RNA結(jié)合蛋白)結(jié)合形成的微處理器蛋白復(fù)合體處理，再形成長約70個核苷酸、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體microRNA(premicroRNA)。然后在轉(zhuǎn)運蛋白Exporti-n5的作用下進入細胞質(zhì)，被胞漿中的RNaseⅢDicer剪切成約22個核苷酸長度的雙螺旋鏈microRNA分子。雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，其中一條鏈被降解，另一條成熟的microRNA以完全或不完全配對方式結(jié)合到與其互補的mRNA靶位，進入RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)中，從而達到抑制蛋白的翻譯或者降解mRNA的目的。還有少數(shù)microRNA反而能激活翻譯［3］。除此外，Wu 等［4］提出microRNA可能還有另外一種調(diào)控機制，即對哺乳動物細胞的靶mRNA有脫腺苷作用。Bartel D P曾對microRNA在基因組、生物合成、作用機制以及功能等方面做了很好的總結(jié)［5］。

2 microRNAs在植入前胚胎的表達

哺乳動物受精后到植入前的胚胎發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，包括受精卵的分裂、緊密態(tài)、桑椹胚和囊胚的形成?，F(xiàn)階段已有大量的研究證明，microRNAs在早期胚胎細胞增殖分化的過程中，表現(xiàn)出明顯的時空特異性。張平和王穎［6］通過芯片分析和RT-PCR等方法在小鼠的卵母細胞、2細胞期、8細胞期和囊胚期篩查到近百個特異性表達的microRNAs，如miR-295在8細胞期以后表達呈漸升趨勢;而miR-125a在卵母細胞到2細胞期階段下降，以后逐漸上升。Argonaute(Ago)是一類龐大的蛋白質(zhì)家族，是組成RISCs復(fù)合物的主要成員。含多個結(jié)構(gòu)域，能準確識別出小RNA向?qū)ф?，從而?dǎo)致目標mRNA的切割或者翻譯的抑制。Garcia-Lopez J 和 del Mao J［7］發(fā)現(xiàn)小鼠除了 Ago1、Ago3、Ago4 在2細胞期以及Ago2在4、8細胞期不明顯外，Drosha酶、Dgcr8、Exportin5、Dicer、Ago1、Ago2、Ago3、Ago4和Ago5基因都是從卵裂期開始下降。表明在受精后至植入前經(jīng)典的microRNA通路都是下降的，同時囊胚期的miR-292-3P和miR-292-5P可作為體內(nèi)潛在的 microRNAs庫存。2013年，Maraghechi等［8］在兔的早期胚胎和胚胎干細胞樣細胞中發(fā)現(xiàn)了特異表達的 OCU-miR-302和 OCU-miR-290家族，OCU-miR-302從早期囊胚表達持續(xù)至ES樣細胞;與此相反，OCU-miR-290集群在早期胚胎發(fā)育過程中較高，在兔ES樣細胞的表達水平卻很低。據(jù)此推測OCU-miR-302集群可能是兔ES樣細胞中與多能性密切相關(guān)的microRNA，而OCU-miR-290集群則在早期胚胎發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用。

在胚胎事件發(fā)育進程中，與發(fā)育相關(guān)的microRNAs表現(xiàn)出特異的表達趨勢，或升高、或降低，從而發(fā)揮獨特的影響胚胎發(fā)育的角色。胚胎發(fā)育本身是一個連續(xù)不斷的過程，伴隨著細胞和組織漸進性的結(jié)構(gòu)和機能變化。即使是同一時期，microRNAs也有不同的空間表達差異。受精卵經(jīng)過6次卵裂后形成囊胚，囊胚腔內(nèi)的細胞繼續(xù)分化，分為胚泡腔、內(nèi)細胞群(inner cell mess，ICM)和外滋養(yǎng)層(trophectoderm，TE)，其中內(nèi)細胞群具有全能性，能分化發(fā)育成完整的個體。Goossens等則通過整體原位雜交和定量RT-PCR分析了牛囊胚期的ICM和TE的microRNA水平，發(fā)現(xiàn)ICM中的bta-miR-155是TE表達量的50倍［9］。Rosenbluth等從捐贈的人類胚胎中檢測到了microRNAs的差異表達，其中整倍體中miR-372的表達量較非整倍體顯著增加，這種明顯的差異表達，可能對囊胚的存活很關(guān)鍵，可能是胚胎最終發(fā)育結(jié)局或其相關(guān)機制的早期暗示［10］。

以上提示我們，小鼠、牛、兔和人類的植入前胚胎的microRNAs表達均具有時間和空間動態(tài)性，且不同的物種具有不同的表達模式。因此，microRNAs在早期胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的作用。

3 microRNAs在早期胚胎發(fā)育過程中的作用

Zondag等［11］通過microRNA測序，發(fā)現(xiàn)在蜜蜂早期胚胎中28%的microRNA都有表達，并且和果蠅一樣有明顯的表達差異。敲除Dicer酶的蜜蜂發(fā)育有缺陷，提示蜜蜂的早期胚胎發(fā)育可能受到了microRNA的作用。同樣，Blakaj也推測如果缺失了合成成熟microRNAs所必需的酶(Dicer或DGCR8)，小鼠早期胚胎發(fā)育就會阻滯，多能干細胞增殖和分化也會受到影響［12］。

改變了成熟microRNA的量，胚胎的發(fā)育就受到明顯的阻滯。反之，人們又構(gòu)造了發(fā)育阻滯的早期胚胎模型，去監(jiān)測這些發(fā)育異常的胚胎的microRNA表達量的變化，得出了相同的結(jié)論。Zhang等［13］將斑馬魚胚胎暴露于可導(dǎo)致發(fā)育毒性的全氟辛烷磺酸或二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，與未暴露組對比，利用基因芯片對已知斑馬魚的219個microRNA的表達譜進行分析，并用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)來驗證microRNA表達微陣列數(shù)據(jù)。最終，暴露全氟辛烷磺酸或DMSO后microRNA表達譜有顯著變化。受精后24h和120h，分別有39個和81個microRNA在暴露全氟辛烷磺酸后表達模式發(fā)生了明顯改變。受精后24h有20個基因顯著上調(diào)，19個明顯下降，而在受精后120h有41個顯著上調(diào)，40個明顯下調(diào)。胚胎接受全氟辛烷磺酸或DMSO暴露，引起了microRNA的一系列表達改變，并可能導(dǎo)致發(fā)育毒性。Mondou等［14］通過基因芯片篩選出牛的植入前早期胚胎的有表達差異的特異microRNA，并選取其中有表達差異的miR-21和miR-130a對牛的卵泡期、分裂期、2細胞期、4細胞期、8細胞期及囊胚期胚胎半定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)成熟的miR-21、miR-130a和miR-130a前體呈線性增加。在2細胞階段對胚胎暴露鵝膏蕈堿后，miR-21、premiR-21和miR-130a顯著減少，提示microRNAs可能對牛的胚胎的早期發(fā)育起著調(diào)節(jié)作用，從而影響到母源基因向胚胎的過渡。

發(fā)育異常的早期胚胎，microRNA的量的改變，提示兩者可能有明顯的相互關(guān)系。金孝華等進一步深入研究發(fā)現(xiàn)miR-21在大鼠胚胎植入期的表達增加，推測miR-21的表達增加可能有利于胚胎植入的發(fā)生［15］。以上對斑馬魚、蜜蜂、鼠類、牛等動物的研究，無論從干預(yù)microRNA表達到影響胚胎的發(fā)育，還是發(fā)育異常胚胎中microRNA的改變，均提示microRNAs在動物早期胚胎發(fā)育過程中可能起了十分重要的作用。

4 microRNAs在早期胚胎發(fā)育中的調(diào)控機制和相關(guān)的靶基因

目前，microRNAs在早期胚胎發(fā)育過程中的作用機制尚不明了。對microRNAs作用機制的探究，主要是通過預(yù)測相關(guān)的靶基因，并進一步驗證。Tripurani等［16］驗證了牛的早期胚胎中miR-196a在4細胞和8細胞期時表達水平增高，且能負調(diào)節(jié)NOBOX基因(newborn ovary homeobox gene)。NOBOX作為一種轉(zhuǎn)錄因子，對早期胚胎發(fā)育的母體效應(yīng)起重要作用，有研究已證實其與小鼠不育密切相關(guān)［17］。這意味著NOBOX在發(fā)育過程中可能降解母源性轉(zhuǎn)錄物，同樣的情況也可在斑馬魚miR-430、非洲爪蟾miR-427和小鼠miR-290上觀察到，揭示了早期發(fā)育中microRNA誘導(dǎo)母源性mRNAs的清除可能是普遍存在的一種機制［18］。Pang等［19］證明了 Siah1a的表達模式與miR-135a呈負相關(guān)，顯微注射miR-135a的抑制劑，超過30%以上的受精卵的第1次分裂被抑制。進一步對注射了miR-135a抑制劑的小鼠同時注射 Siah1a特異性抗體，一定程度上抵消了miR-135a的抑制作用。因此，miR-135a可能是通過調(diào)節(jié)Siah1a的表達，來調(diào)節(jié)合子的第1次細胞分裂，參與蛋白酶體降解的調(diào)控。

microRNAs在著床前胚胎的表觀調(diào)控途徑中也可能起到一定的作用。Takada等［20］通過m-RAP分析發(fā)現(xiàn)，miR-29b可能通過作用于Dnmt3a和 Dnmt3b，調(diào)控小鼠原生殖細胞基因組甲基化，從而在雌性性腺發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近期Lee等［21］研究得出結(jié)論在小鼠桑椹胚向囊胚過渡過程中microRNAs受DNA甲基化影響。該實驗用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑對胚胎進行處理后，通過實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，桑椹胚向囊胚的發(fā)育被抑制，microRNAs基因中總共有48個下調(diào)、17個上調(diào)，包括 let-7e，miR-20a，miR-21，miR-34b，miR-128b 和miR-452等，并最后證實了8個以上可能作用的靶基因。

Wong［22］發(fā)現(xiàn) miR-125b 能抑制 Nanog 和 Oct4的表達，抑制人類胚胎干細胞多能性，參與早期胚胎事件，促進中胚層分化。LEE等［23］研究結(jié)果明確提示miR-124a通過下調(diào)SLUG和IQGAP1的表達，抑制胚胎干細胞向原腸胚形成，從而保持干細胞特性。Foshay發(fā)現(xiàn)miR-17家族在哺乳動物的早期發(fā)育中表達，且能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)已知的干細胞調(diào)節(jié)器STAT3來參與干細胞分化，促進或降低胚層分化［24］。Colas等［25］篩選了小鼠全基因組的 microRNA，發(fā)現(xiàn)let-7和miR-18在早期胚胎過程中胚層形成起調(diào)節(jié)作用，兩者是直接作用于Acvr1b和Smad2的3'-UTR?？梢妋icroRNAs在早期胚胎的胚層分化過程中，也起了不小的作用。Lu等［26］通過將胚胎的培養(yǎng)外環(huán)境HCO3-濃度降低，或者抑制囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)后，發(fā)現(xiàn) miR-125b的表達水平下降，下游的P53上升，細胞生命周期受到影響，從而影響了胚胎的發(fā)育。Byrne等比較了Ped基因陰性(B6K1)和陽性(B6K2)的鼠胚胎各個時期miR-125a的表達，發(fā)現(xiàn)Ped基因陰性小鼠的囊胚期miR-125a水平10倍高于陽性小鼠，提示Ped基因可能是通過調(diào)控miR-125a的表達途徑，來調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育［27］。

Liu等［28］篩選出休眠和激活的小鼠囊胚的238個microRNAs中有45個表達差異。增加小鼠囊胚期let-7a的表達后，體內(nèi)植入率下降，體外囊胚著床和生長均受影響。過表達與植入相關(guān)的分子Integrinbeta3后，let-7a的作用可被抑制，let-7a可能通過調(diào)節(jié)Integrin-beta3來參與植入過程。

綜上所述，microRNAs可能通過降解母源性mRNA、抑制合子有絲分裂、表觀調(diào)控機制等調(diào)節(jié)胚層分化、影響植入等環(huán)節(jié)，通過作用于相關(guān)的靶基因，在早期胚胎事件中發(fā)揮微妙而獨特的生理作用。相關(guān)復(fù)雜的調(diào)控機制還需要進一步的探索。

5 展 望

目前根據(jù)microRNA可能的作用機制，對于microRNA在胚胎中的研究大致有2種思路［29］:一是通過突變生物體，如microRNAs生成所必需的酶突變或缺失時來驗證microRNA在早期胚胎發(fā)育中的正常作用。二是對于人類等大型哺乳動物，選擇基因芯片和/或生物信息學(xué)從胚胎或干細胞對比篩選出特異性microRNAs，過表達或抑制特異性microRNAs，分析其在胚胎干細胞中的功能［14］。具體的技術(shù)方法主要有:①直接克隆和測序列;②借助計算機和數(shù)據(jù)庫，microRNA芯片對基因組的生物信息學(xué)搜索;③Northern雜交和原位雜交等方法;④靶向抑制基因序列的人工構(gòu)建的內(nèi)含子iRNA;⑤TaqMan探針法進行實時定量 PCR［30］。

microRNAs除了在早期胚胎發(fā)育過程中起重要作用外，在腫瘤細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞的分化等方面也起到重要作用［31－32］。參與生物體生長發(fā)育和細胞分化調(diào)控的研究，為我們了解生物的正常成長及疾病的發(fā)生診斷提供了強有力的工具和全新的思維。然而，目前已被驗證的并且功能明確的microRNA的數(shù)量還是甚少，其在各種生命活動中所扮演的角色尚未完全明確。隨著研究的深入，microRNA研究中還存在一些需要解決的問題:如靶基因的預(yù)測和確定;調(diào)控microRNA表達的相關(guān)因子的鑒定;某個microRNA的準確表達時間的測定;以及眾多microRNA如何整合為一個復(fù)雜龐大的分子網(wǎng)絡(luò)等。正確認識和掌握microRNA在早期胚胎發(fā)育過程中的作用和機制，對于提高人類輔助生殖技術(shù)的成功率以及降低流產(chǎn)率，可以提供新的臨床思路。

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