王桂平，張彥燾，劉新艷，潘學兵，周 瓊，郭俐麟

（1.廣州醫(yī)科大學衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院藥學系，廣東廣州510180；2.廣州醫(yī)科大學藥物研究中心，廣東廣州510182）

·實驗研究·

苯扎貝特協(xié)同順鉑抑制肺腺癌細胞生長和誘導(dǎo)凋亡

王桂平1，張彥燾1，劉新艷2，潘學兵1，周 瓊1，郭俐麟1

（1.廣州醫(yī)科大學衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院藥學系，廣東廣州510180；2.廣州醫(yī)科大學藥物研究中心，廣東廣州510182）

目的觀察過氧化物酶體增殖因子激活受體α（PPARα）激動劑苯扎貝特聯(lián)用順鉑對肺腺癌A549細胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的協(xié)同效應(yīng)及可能機制。方法采用CCK8法測定不同濃度苯扎貝特處理A549細胞的生長曲線，觀察苯扎貝特、順鉑及兩藥聯(lián)用對A549細胞的生長抑制作用，并應(yīng)用中效原理評價兩藥聯(lián)用效應(yīng)；采用流式細胞技術(shù)分析苯扎貝特與順鉑聯(lián)用對細胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并通過qRT－PCR檢測A549細胞中VEGF和HIF－1α mRNA的表達變化。結(jié)果苯扎貝特聯(lián)合順鉑呈現(xiàn)明顯協(xié)同抑制效應(yīng)，兩藥聯(lián)用時IC50值為15.92μmol·L－1，當苯扎貝特濃度小于588μmol·L－1，順鉑濃度小于206μmol·L－1，CI值小于1，即兩藥合用均產(chǎn)生協(xié)同作用。聯(lián)合用藥組細胞凋亡率明顯高于單藥組（P＜0.05），并且聯(lián)合用藥組較單藥組顯著下調(diào)VEGF和HIF－1αmRNA的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論苯扎貝特聯(lián)合順鉑對肺癌細胞具有協(xié)同抑制效應(yīng)，并可有效誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)VEGF和HIF－1α的表達有關(guān)。

苯扎貝特；順鉑；肺腺癌；協(xié)同效應(yīng)；過氧化物酶體增殖物激活受體

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，居惡性腫瘤第一位。非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是最常見的肺癌病理類型，占80%以上，而肺腺癌則是最常見的NSCLC之一［1］。單一藥物化療用藥劑量較大、副作用較多且療效不甚理想，因此，聯(lián)合化療是惡性腫瘤治療的重要方法。含鉑二藥聯(lián)合化療是NSCLC的一線化學治療方案，特別是第三代化療藥物如長春瑞賓、吉西他濱等可與鉑類藥物產(chǎn)生較為理想的聯(lián)用效果［2，3］，然而，這些一線聯(lián)用療效已達平臺期，因此，探索新的含鉑類藥物聯(lián)合化療方案，對進一步提高NSCLC的治療效果，有著重要意義。

過氧化物酶體增殖因子激活受體（peroxisome proliferators activated receptors，PPARs）是一類與腫瘤和多種代謝性疾病密切相關(guān)的配體依賴活化的核轉(zhuǎn)錄因子。PPARs有3種亞型，即PPARα、PPARβ和PPARγ，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、影響細胞增殖和分化等多種生物學功能［4］。PPARα是第一個被鑒別出來的PPAR亞型，研究發(fā)現(xiàn)其與乳腺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌和胰腺癌等多種腫瘤關(guān)系密切，而PPARα激動劑則可抑制多種腫瘤細胞的生長，因此，PPARα有可能成為一種新的腫瘤治療靶點［5～7］。本研究主要研究PPARα受體激動劑苯扎貝特與順鉑聯(lián)合，觀察其對肺癌A549細胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，以期為肺癌的臨床治療探索出一種新的治療思路。

1 材料與試劑

苯扎貝特（Bezafibrate）和順鉑（Cisplatin，DDP）均購自Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)基（Gibico公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物），qRT－PCR System（廣州萊德爾生物科技有限公司）和CCK8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。Sunrise酶標儀（瑞士Tecan公司），XDS－1B倒置相差顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）及Forma 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）。肺腺癌細胞株A549由廣州醫(yī)科大學實驗中心提供。

2 方法

2.1 A549肺腺癌細胞培養(yǎng) 人肺腺癌細胞A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、雙抗（青霉素100 U·mL－1、鏈霉素100 U·mL－1）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，以0.25%的胰蛋白酶消化傳代，約3 d傳代1次。

2.2 A549細胞生長曲線 采用CCK8試劑盒測定A549細胞生長曲線。將A549細胞以5×103／孔的密度接種96孔板，實驗設(shè)對照組和藥物組，藥物組分別加不同濃度的藥物，對照組則加入等量培養(yǎng)基，每個濃度平行接種3孔。分別在接種1、2、3、4、5 d和6 d后，加入10μL CCK8混合液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后去除上清，在酶標儀上讀取OD值（波長為450 nm），以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。

2.3 苯扎貝特聯(lián)用順鉑對肺腺癌細胞增殖抑制作用 細胞增殖抑制實驗采用CCK8試劑盒，具體操作按說明書進行。收集對數(shù)生長期A549細胞，按5 ×105·L－1密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL。實驗設(shè)苯扎貝特組、順鉑組、順鉑＋苯扎貝特組及對照組。藥物處理48 h后，各孔加入CCK8混合液10 μL，37℃孵育3 h，在酶標儀450 nm波長測定其OD值，實驗重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均OD值，進行統(tǒng)計學處理。計算細胞抑制率［抑制率%＝（1－A處理組／A對照組）×100%］。以細胞抑制率對不同藥物濃度的對數(shù)作圖，繪出抑制曲線，用CalcuSyn 2.0軟件（Biosoft，USA）計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。采用中效原理評價藥物聯(lián)合應(yīng)用效應(yīng)［8］。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡［9］取對數(shù)生長期的人肺腺癌A549細胞，按1×106·mL－1以2 mL體積接種于6孔板內(nèi)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。實驗組加入以培養(yǎng)基RPMI1640配制的不同濃度的藥物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)。細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，離心管收集細胞懸液，然后加入70%冰乙醇5 mL混勻固定，4℃放置24 h以上。然后加入無RNA酶的碘化丙啶（PI）染色，室溫避光15 min，300目濾網(wǎng)過濾后，進行流式細胞檢測，實驗重復(fù)3次。

2.5 熒光定量PCR 檢測A549細胞VEGF和HIF－1αmRNA表達藥物干預(yù)24 h后，采用RNeasy Mini Kit抽提樣品中總RNA，并對所提取的RNA進行純度檢測及總RNA完整性檢測等質(zhì)量評估。每個20μL的PCR反應(yīng)，加入50 ng總RNA，特異引物和TaqMan引物終濃度分別為300 nmol·L－1和200 nmol·L－1，與12.5μL TaqMan Universal qPCR MasterMix混合進行PCR擴增；PCR參數(shù)為：95℃變性5 min，然后40循環(huán)：95℃（15 s），60℃（15 s）及72℃（30 s）。以18S rRNA作內(nèi)參對照，熒光信號由ABIPrism 7300 Sequence Detection System（Applied Biosystems）檢測。靶基因及內(nèi)參引物如下：HIF－1α：5－GTGGATTACCACAGCTGA－3（forward），5－GCTCAGTTAACTTGATCCA－3（reverse）；VEGF：TGTCTAATGCCCTGGAGCCT（forward），GCTTGTCACATCTGCAAGTACG（reverse）；18S＃rRNA：5－CCTGGATACCGCAGCTAGGA－3（for-ward），５－GCGGCGCAATACGAATGCCCC－3（reverse）。

2.6 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組資料之間的比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），方差分析顯著時，采用LSD（least significant difference）或SNK（student neuman keuls）法進行各組均數(shù)間的多重比較，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 細胞生長曲線 采用CCK8法測定肺腺癌A549細胞及不同濃度苯扎貝特處理A549細胞的生長曲線，實驗結(jié)果如圖1所示。正常狀態(tài)下，A549細胞12 d生長較緩慢，2～4 d為快速增殖期，隨后細胞增殖變緩慢。苯扎貝特對A549有抑制作用，并且隨著苯扎貝特劑量增大，其抑制率也增高；200 μmol·L－1或400μmol·L－1的苯扎貝特可對A549產(chǎn)生明顯的抑制作用。

圖1 CCK8法測定A549細胞生長曲線

3.2 中效濃度及合用指數(shù)的計算 本研究應(yīng)用中效原理對苯扎貝特與順鉑聯(lián)用的作用進行評價。依據(jù)順鉑和苯扎貝特的IC50而確定苯扎貝特與順鉑聯(lián)合用藥比例為2.85∶1。應(yīng)用劑量－效應(yīng)分析軟件（CalcuSyn 2.0），計算出苯扎貝特、順鉑單用及合用時斜率（m）、中效濃度（Dm）及相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見表1。依據(jù)中效原理，計算出苯扎貝特和順鉑聯(lián)合應(yīng)用時的合用指數(shù)combination index（CI）與作用效應(yīng)（fa）的關(guān)系，具體見圖2，當bezafibrate濃度小于588μmol·L－1，順鉑濃度小于206μmol·L－1，CI值小于1，即兩者合用產(chǎn)生協(xié)同作用。

3.3 苯扎貝特與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對細胞凋亡的影響

細胞凋亡實驗結(jié)果見表2，與對照組相比，苯扎貝特組（200μmol·L－1）、順鉑組（100μmol·L－1）及兩藥聯(lián)用組的早期凋亡率、晚期凋亡率及總凋亡率均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），特別是當兩藥聯(lián)用時，細胞凋亡率統(tǒng)計學差異顯著（P＜0.001）。

表1 苯扎貝特、順鉑單用及合用時斜率（m）、中效濃度（Dm）及相關(guān)系數(shù)（r）

圖2 苯扎貝特與順鉑合用時的效應(yīng)與合用指數(shù)的關(guān)系

表2 苯扎貝特與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對A549細胞凋亡的影響（s，n＝3）

表2 苯扎貝特與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對A549細胞凋亡的影響（s，n＝3）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.001；與苯扎貝特組或順鉑組比較，＃P＜0.05，＄P＜0.001

組別 早期凋亡率（%）晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）4.08±0.07 7.37±0.94 11.45±1.10苯扎貝特（200μmol·L－1） 7.23±0.74* 22.68±1.01** 29.91±1.55**順鉑（100μmol·L－1） 6.02±0.66* 25.51±1.49** 31.53±1.80**苯扎貝特＋順鉑 13.70±1.56**＃37.67±2.08**＃ 51.37±3.65**＄對照組

3.4 苯扎貝特與順鉑聯(lián)合應(yīng)用下調(diào)VEGF和HIF－1αmRNA表達 本研究采用qRT－PCR檢測苯扎貝特、順鉑或是兩藥聯(lián)用對VEGF和HIF－1α mRNA表達影響，實驗結(jié)果見圖3。100μmol·L－1苯扎貝特或100μmol·L－1順鉑均可下調(diào)VEGF和HIF－1αmRNA表達，特別是兩藥聯(lián)用組下調(diào)VEGF和HIF－1αmRNA表達的效果較100μmol·L－1苯扎貝特或100μmol·L－1順鉑組明顯（P＜0.05）。

4 討論

近年來，PPARα激動劑的抗腫瘤作用逐漸受到關(guān)注，該類制劑可抑制結(jié)腸癌、白血病、黑色素瘤及乳腺癌等腫瘤細胞生長［5～7］，提示PPARα受體激動劑可能成為一種高效低毒的抗腫瘤藥物。本研究主要探討PPARα受體激動劑苯扎貝特和順鉑聯(lián)合應(yīng)用對肺腺癌A549細胞的增殖抑制效應(yīng)，從而為臨床尋找新的化療增敏劑提供理論和實驗依據(jù)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)苯扎貝特和順鉑聯(lián)合可產(chǎn)生良好協(xié)同抑制A549細胞的效應(yīng)，而且合用時中效濃度及各自所需用量均比單用時要?。ㄒ姳?）。順鉑單用時Dm為69.63μmol·L－1，合用時Dm為4.2 μmol·L－1，合用時比單用時小16.5倍；而苯扎貝特單用時Dm為147.8μmol·L－1，合用時Dm為11.8μmol·L－1，合用時比單用時小12.5倍。這說明聯(lián)合用藥各藥只需較少的劑量即可產(chǎn)生較好的抗腫瘤效果，可減少和避免了順鉑單獨應(yīng)用的毒性反應(yīng)。同時，從苯扎貝特與順鉑合用的效應(yīng)與合用指數(shù)關(guān)系（見圖2）中可以看出，隨著兩藥劑量的增加，其效應(yīng)fa和CI也相應(yīng)增加，當效應(yīng)fa＞0.9時，兩藥合用指數(shù)CI＞1，產(chǎn)生拮抗效應(yīng)；fa＜0.9時，CI＜1，兩藥合用可產(chǎn)生協(xié)同作用，即當按苯扎貝特＜588 μmol·L－1與順鉑＜206μmol·L－1的劑量聯(lián)合用藥時，可產(chǎn)生協(xié)同作用。近期，王績英等［10］報道非諾貝特與順鉑或三氧化二砷聯(lián)用可以增強細胞增殖抑制作用；而Murray等［11］也報道苯扎貝特與甲孕酮聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同抗急性白血病作用。上述數(shù)據(jù)說明，貝特類藥物可增加順鉑或其他抗腫瘤藥物的抗癌作用。然而，不同比例苯扎貝特與順鉑的聯(lián)合用藥會對聯(lián)合效應(yīng)產(chǎn)生什么樣的影響，苯扎貝特與順鉑以什么比例聯(lián)合可達最好效應(yīng)？此外，兩藥合用時給藥時間先后次序不同，對合用效應(yīng)是否有影響？這些問題仍需進一步的研究。

圖3 苯扎貝特（BEZ）、順鉑（DDP）及兩藥聯(lián)用對A549細胞VEGF（A）和HIF－1α（B）mRNA表達的影響

目前，PPARα受體激動劑抗腫瘤機制尚不清楚，認為可能與調(diào)控細胞周期、抑制炎癥反應(yīng)、抗血管生成及誘導(dǎo)細胞凋亡等有關(guān)［5～7］。HIF－1α和VEGF與許多腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，特別是在肺癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程扮演重要角色，例如HIF－1α異常表達與肺癌的組織分期和細胞分型等過程密切相關(guān)，而VEGF異常表達可作為肺癌的早期診斷和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一項重要指標，并且HIF－1α和VEGF已成為肺癌治療的重要靶位［12，13］。本研究觀察到苯扎貝特或與順鉑的聯(lián)用均可有效誘導(dǎo)A549細胞凋亡，并且通過qRT－PCR發(fā)現(xiàn)苯扎貝特下調(diào)HIF－1α和VEGF基因的表達，提示苯扎貝特抑制A549細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡可能與下調(diào)HIF－1α和VEGF基因的表達有關(guān)，此與其他學者的發(fā)現(xiàn)相一致。例如Yokoyama等［14］報道PPARα受體激動劑氯貝酸可通過下調(diào)VEGF的表達從而抑卵巢癌的生長；Parums等［12］發(fā)現(xiàn)非諾貝特也可以通過抑制腫瘤細胞分泌VEGF和FGF等機制抑制腫瘤血管的生成。Zhou等［15］報道PPARα受體激動劑可下調(diào)乳腺癌（MCF－7）和卵巢癌（A2780）細胞中HIF－1α的表達，抑制HIF－1α信號傳導(dǎo)通路和VEGF的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。由上述數(shù)據(jù)推測，HIF－1α和VEGF可能是PPARα受體信號傳導(dǎo)通路中的重要分子，苯扎貝特等PPARα受體激動劑可能是通過活化PPARα受體，使HIF－1α和VEGF等分子表達下調(diào)，從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。然而，有研究表明在人的血管內(nèi)皮細胞中非諾貝特可通過PPARα非依賴性的方式發(fā)揮作用，苯扎貝特是通過“依賴PPARα方式”，還是“非依賴PPARα方式”下調(diào)肺癌細胞中HIF－1α和VEGF的表達，此仍需要進一步研究。

［1］楊玲，李連弟，陳育德，等.中國肺癌死亡趨勢分析及發(fā)病、死亡的估計與預(yù)測［J］.中國肺癌雜志，2005，8（4）：274－278.

［2］Kim HJ，Kim TG，Lee HJ，et al.A phase II study of combination chemotherapy with docetaxel and carboplatin for elderly patientswith advanced non－small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2010，68（2）：248－252

［3］Goss GD，Arnold A，Shepherd FA，et al.Randomized，double－blind trial of carboplatin and paclitaxel with ei-ther daily oral cediranib or placebo in advanced nonsmall－cell lung cancer：NCIC clinical trials group BR24 study［J］.JClin Oncol，2010，28（1）：49－55.

［4］Schoonjans K，Staels B，Auwerx J.The peroxisome proliferator activated receptors（PPARS）and their effects on lipid metabolism and adipocyte differentiation［J］.Biochem Biophys Acta，1996，1302（2）：93－109.

［5］Maggiora M，Bologna M，CerùMP，et al.An overview of the effectof linoleic and conjugated－linoleic acids on the growth of several human tumor cell lines［J］.Int JCancer，2004，112（6）：909－919.

［6］Saidi SA，Holland CM，Charnock－Jones DS，et al.In vitro and in vivo effects of the PPAR－alpha agonists fenofibrate and retinoic acid in endometrial cancer［J］.Mol Cancer，2006，5：13.

［7］Thuillier P，Anchiraico GJ，Nickel KP，et al.Activators of peroxisome proliferator－activated receptor－αpartially inhibit mouse skin tumor promotion［J］.Mol Carcinog，2000，29（3）：134－142.

［8］Xu SP，Sun GP，Shen YX，et al.Synergistic effect of combining paeonol and cisplatin on apoptotic induction of human hepatoma cell lines［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28（6）：869－878.

［9］Wang G，Ye Y，Yang X，et al.Expression－based in silico screening of candidate therapeutic compounds for lung adenocarcinoma［J］.PLoSOne，2011，6（1）：e14573.

［10］王績英，王濤，曾錦榮，等.非諾貝特聯(lián)用順鉑對人肺癌A549細胞抑制和凋亡的實驗研究［J］.山東醫(yī)藥，2011，51（48）：10－13.

［11］Murray JA，Khanim FL，Hayden RE，et al.Combined bezafibrate and medroxyprogesterone acetate have efficacy without haematological toxicity in elderly and relapsed acute myeloid leukaemia（AML）［J］.Br J Haematol，2010，149（1）：65－69.

［12］Parums DV.Current status of targeted therapy in nonsmall celllung cancer［J］.Drugs Today（Barc），2014，50（7）：503－525

［13］Ren W，Mi D，Yang K，et al.The expression of hypoxiainducible factor－1αand its clinical significance inlung cancer：a systematic review and meta－analysis［J］.Swiss Med Wkly，2013，143：w13855.

［14］Yokoyama Y，Xin B，Shigeto T，etal.Clofibric acid，a peroxisome proliferator－activated receptor alpha ligand，inhibits growth of human ovarian cancer［J］.Mol Cancer T-her，2007，6（4）：1379－1386.

［15］Zhou J，Zhang S，Xue J，et al.Activation of peroxisome proliferator－activated receptorα（PPARα）suppresses hypoxia－inducible factor－1α（HIF－1α）signaling in cancer cells［J］.J Biol Chem，2012，287（42）：35161－35169.

Inhibition effects of bezafibrate in coordination w ith cisp latin on cell grow th and inducing apoptosis of lung adenocarcinoma cells

WANG Gui-ping1，ZHANG Yan-tao1，LIU Xin-yan2，PAN Xue-bing1，ZHOU Qiong1，GUO Li-lin1
（1.Department of Pharmacy，Health Collegy，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China；2.Drug Research Center，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China）

ObjectiveTo observe the effects of peroxisome proliferator－activated receptorα（PPARα）agonistbezafibrate combinated with cisplatin（DDP）on proliferation and apoptosis of lung adenocarcinoma（AC）A549 cell and the possiblemechanism.MethodsCCK8 kit assay was used to detect growth inhibiton curve of A549 cells treated with various concentrations of bezafibrate.Themedian－effectmethod was used to evaluate the combination effect.Cell apoptosiswas evaluated with flow cytometry，and the expression of VEGF and HIF－1αmRNA were analyzed using real－time PCR（qRT－PCR）.ResultsBezafibrate combinated with DDP showed significately synergy inhibition effect，and the IC50was 15.92 μmol·L－1when the two agentswere combined.The combination index（CI）was less than 1 when the concentration of bezafibrate＜588μmol·L－1and cisplatin＜206μmol·L－1，namely two drugs combination showed synergy effect.The cell apoptosis rate of A549 cellswas significately higher than single drug group（P＜0.05）.The expression level of VEGF and HIF－1αmRNA were significately lower in combination group than in bezafibrate or cisplatin group（P＜0.05）.ConclusionOur results demonstrated that bezafibrate combinated with cisplatin showed synergy inhibition effect on lung AC，which may be related with the down－expression of VEGF and HIF－1α.

Bezafibrate；Cisplatin；Lung adenocarcinoma；Synergy effect；PPAR

R979.1

A

2095－5375（2014）11－0621－005

廣東省自然科學基金項目（No.S2011010004147）；廣州醫(yī)科大學2011年科研基金博士啟動基金（No.2011C06）

王桂平，男，博士研究生，研究方向：抗腫瘤藥物篩選及機制研究，E－mail：docgpwang＠163.com