韓啟燦，霍光華，羅桂祥，胡殿民，張 寶，陳明輝

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/南昌市生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中腸道疾病嚴(yán)重影響動(dòng)物的生長(zhǎng)與發(fā)育，為誘發(fā)幼崽高死亡率的主要原因。大腸桿菌(E.coli)和食源性金黃色葡萄球菌(S.aureus)分泌的腸毒素等是引起畜禽腹瀉與食物中毒的主要原因之一[1]。目前，畜禽腹瀉的主要治療對(duì)策是在飼料中添加抗生素、化學(xué)合成藥物等，然而該類藥物長(zhǎng)期使用已經(jīng)造成了病原抗藥性和生物富集[2]，開發(fā)綠色飼料添加劑已成為該領(lǐng)域的發(fā)展方向。雙孢菇、白林地菇[3]、蜜環(huán)菌[4]、菌草靈芝[5]、榆耳[6]等野生大型真菌具廣譜抗菌活性，某些用作飼料添加劑已展示出應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)從56 種野生大型真菌中篩選到一株對(duì)S.aureus、E.coli 等病原菌具有強(qiáng)抑制活性的野生冬菇(Flammulina ssp)0612-9，進(jìn)而探明了該菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件和抗菌物質(zhì)的提取條件，以提高其所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基 56 種野生大型真菌的野生分離菌(具體名稱略)、S.aureus、E.coli、白色念珠菌(M.albican)的標(biāo)準(zhǔn)菌株均由南昌市生物資源保護(hù)和利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、種子液體培養(yǎng)基、發(fā)酵液體培養(yǎng)基[7]、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(葡萄糖20 g、麩皮10 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、維生素B1 0.1 g，加水至1 000 mL，pH 自然)均由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 篩選抗菌活性菌株 發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制活性試驗(yàn)按照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.3 活性菌株發(fā)酵液效價(jià)的測(cè)定 以S.aureus 為指示菌，鹽酸四環(huán)素(1 mg=1 000 U)為標(biāo)準(zhǔn)品，采用一劑量法測(cè)定濃縮5 倍發(fā)酵液的效價(jià)[9]。

1.4 抗菌活性物質(zhì)的發(fā)酵生產(chǎn)條件

1.4.1 培養(yǎng)基組成優(yōu)化 單因子法優(yōu)選碳氮源：等量的常用碳氮源(碳源：蔗糖、葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、甘露糖；氮源：麩皮、蛋白胨、酵母粉、硝酸銨、尿素)分別替換發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的相應(yīng)成分，進(jìn)行發(fā)酵及其發(fā)酵液抗菌活性測(cè)定。響應(yīng)面設(shè)計(jì)：?jiǎn)我蛩貎?yōu)化基礎(chǔ)上，首先采用N=12 的Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出主因素，然后通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最后采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析對(duì)主因素作進(jìn)一步優(yōu)化。

1.4.2 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化 在上述發(fā)酵條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，以搖床溫度、發(fā)酵周期、培養(yǎng)基初始pH 值和接種量為考察因素，采用L16(45)的正交設(shè)計(jì)對(duì)野生冬菇生產(chǎn)抗菌物質(zhì)的發(fā)酵條件作進(jìn)一步的優(yōu)化。

1.4.3 抗菌活性物質(zhì)的提取條件 抗菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性：熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性和紫外照射穩(wěn)定性試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。抗菌活性物質(zhì)提取劑選擇試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[10]。

1.4.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和計(jì)算 采用SASJMP9.0.2 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 廣譜抗菌活性菌株的獲得 本研究篩選到一株具廣譜抗菌活性的野生冬菇0612-9，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其發(fā)酵液對(duì)S.aureus、E.coli 及M.albican 的抑菌圈直徑分別為23.26 mm、16.12 mm、19.70 mm，抑菌效果均屬高度敏感。發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對(duì)S.aureus的MIC 為1.25 mg/mL；10 mg/mL 發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物抑菌圈直徑為20.48 mm，與同等濃度鹽酸四環(huán)素(抑菌圈為21.04 mm)的抑菌效果相近(圖1)。

2.2 發(fā)酵液的效價(jià) 以鹽酸四環(huán)素對(duì)S.aureus 的抑菌圈直徑校正值為縱坐標(biāo)，鹽酸四環(huán)素濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2A)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=8.0976X-18.750，R2=0.980，其中Y 為抑菌圈直徑的校正值(用250 ppm 的鹽酸四環(huán)素來(lái)校正抑菌圈直徑)，X 為鹽酸四環(huán)素濃度的對(duì)數(shù)值(圖2B)。

圖1 野生冬菇菌株0612-9 發(fā)酵液的抗病菌活性檢測(cè)Fig.1 Antibacterial activity of fermentation broth from Flammulina ssp strain 0612-9

圖2 野生冬菇菌株0612-9 發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑制效價(jià)Fig.2 Determination of inhibitory titer of fermentation liquid on S.aureus

經(jīng)測(cè)定，野生冬菇發(fā)酵液抗S.aureus 的抑菌圈直徑平均校正值為7.76 mm(發(fā)酵液與250 ppm 四環(huán)素分別形成的抑菌圈直徑之差，即23.48 mm～15.72 mm)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得到5 倍濃縮發(fā)酵液的相對(duì)效價(jià)為1 806.34 U/mL。

2.3 0612-9菌株發(fā)酵培養(yǎng)基碳、氮源篩選 以葡萄糖、麩皮汁作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳、氮源時(shí)，所得發(fā)酵液對(duì)S.aureus 的抑菌圈分別達(dá)到20.71 mm、20.43 mm，抑菌活性顯著高于其他供試碳氮源(表1)，試驗(yàn)結(jié)果表明0612-9 菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗菌物質(zhì)的最佳碳、氮源分別為葡萄糖與麩皮汁。

2.4 顯著因素的Plackett-Burman篩選 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析和方差擬合，獲得抑菌圈直徑(Y)與自變量的多元一次回歸模型為：Y=17.15+3.238X1+0.367X2+1.168X3+0.44X4-1.705X5+0.337X6+0.65X7+0.895X8+0.643X9+0.397X10(X1馬鈴薯、X2葡萄糖、X3麩皮、X4KH2PO4、X5MgSO4·7H2O、X6接種量、X7轉(zhuǎn)速、X8發(fā)酵周期、X9溫度、X10裝液量)。該模型擬合性評(píng)價(jià)表明，其決定系數(shù)R2為0.991，擬合性良好。

t 檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，該菌株發(fā)酵生產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的極顯著(置信度大于99 %)影響變量有馬鈴薯、MgSO4·7H2O，顯著(95 %<置信度<99 %)影響變量為麩皮。其中馬鈴薯、麩皮為正效影響因素，MgSO4·7H2O 為負(fù)效影響因素。后續(xù)試驗(yàn)選擇土豆、麩皮、MgSO4·7H2O 三因素作進(jìn)一步優(yōu)化。

表1 不同碳、氮源對(duì)抗菌活性的影響Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on antibacterial activity

表2 N=12 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(指示菌為S.aureus)Table 2 Plackett-Burman design and result(indicator bacteria:S.aureus)

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域 表3 顯示，處理3 所得響應(yīng)值最大，采用第3 次實(shí)驗(yàn)條件為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素的中心水平點(diǎn)作進(jìn)一步優(yōu)化，其余因素取值為：葡萄糖30 g/L，KH2PO42 g/L、接種量10 mL/100 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度28 ℃、裝液量100 mL、發(fā)酵周期10 d。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results along the path of steepest ascent

2.6 中心組合試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。擬合獲得二次多元方程為：Y=23.391+0.683X1+0.788X3-0.696X5-0.479X1X3-0.281X1X5-0.181X3X5-0.861X12-0.813X32-0.970X52，其中Y 為抑菌圈直徑。該二次多元回歸方程的決定系數(shù)R2為0.9273，擬合性較好，所以該方程可用來(lái)預(yù)測(cè)和分析0612-9 菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌物質(zhì)的活性強(qiáng)弱。回歸分析顯示，所有一次項(xiàng)與二次項(xiàng)對(duì)發(fā)酵液抗菌活性均有顯著影響(p<0.05)(表5)，然而交互項(xiàng)影響均不顯著，表明三因素之間交互作用相對(duì)較小。響應(yīng)面及等高線圖(圖3)表明，響應(yīng)曲面的頂點(diǎn)與等高線的中心點(diǎn)均在所選的因素水平內(nèi)，表明該水平范圍內(nèi)存在極大值。計(jì)算可得：土豆為270.53 g/L，麩皮7.429 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.4551 g/L 時(shí)取得最大響應(yīng)值26.84 mm。

2.7 野生冬菇發(fā)酵條件的正交試驗(yàn) 表6 表明，四因素對(duì)野生冬菇發(fā)酵上清液的抗菌活性均有不同程度的影響，極差數(shù)值比較表明搖床溫度影響最為顯著，依次是接種量、發(fā)酵周期和培養(yǎng)基的初始pH值。水平極差分析結(jié)果表明野生冬菇搖瓶發(fā)酵產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件組合是：搖床溫度27 ℃、接種量5 %、發(fā)酵周期為11 d、培養(yǎng)基初始pH 值為4.0。

2.8 最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù) 綜上所述，野生冬菇發(fā)酵生產(chǎn)抗菌物質(zhì)的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：土豆270.53 g/L，麩皮7.429 g/L，葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O 0.4551 g/L，KH2PO42 g/L，培養(yǎng)基初始pH 值為4.0，發(fā)酵周期11 d，接種量5 mL/100 mL，轉(zhuǎn)速180 r/min，搖床溫度27 ℃，裝液量100 mL/250 mL。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design and result of central composite method

表5 中心組合模型的回歸系數(shù)評(píng)價(jià)Table 5 Estimation of regression coefficients for central composite design model

圖3 3 個(gè)主因素影響抗菌活性的響應(yīng)面及等高線Fig.3 The response surface and contour curve for antibacterial effects of three main factors

2.9 抗菌活性物質(zhì)提取

2.9.1 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性 為了能夠控制抗菌物質(zhì)提取過(guò)程中的條件，本實(shí)驗(yàn)研究了溫度、pH 和紫外照射對(duì)發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)活性的影響，結(jié)果表明當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃、pH>6.0 時(shí)抗菌物質(zhì)顯著失活，而該抗菌物質(zhì)對(duì)紫外線照射不敏感(圖4)。

表6 野生冬菇發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The results of orthogonal test of the fermentation conditions of wild Flammulina ssp

圖4 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性Fig.4 Stability of antimicrobial substance

2.9.2 抗菌物質(zhì)提取劑的選擇 表7 顯示，發(fā)酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取相均表現(xiàn)出抑菌活性，而石油醚萃取相無(wú)抑菌活性。據(jù)相似相容原理，可大致判斷該抗菌物質(zhì)為中等極性。乙酸乙酯對(duì)發(fā)酵液抗菌成分的提取效果最佳，因此選用乙酸乙酯作為發(fā)酵上清液抗菌物的提取溶劑。菌絲體各萃取相均無(wú)抗菌活性，表明抗菌物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。

表7 液體發(fā)酵產(chǎn)物各萃取組分抑菌活性Table 7 Antibacterial activity of extracts from liquid fermentation product

3 討論

真菌液體培養(yǎng)過(guò)程中，發(fā)酵液產(chǎn)生多糖、多肽、核酸、酶、甾醇、維生素及具有抗生素作用的多種化合物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，并且具有抗菌、抗癌、消炎、提高免疫等生物活性。目前，從藥用大型真菌中探尋天然抗菌劑的研究也有報(bào)道。馬慧妮等2006年研究表明多孔菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取物能夠顯著抑制S.aureus、E.coli 和枯草芽孢桿菌[11]。

真菌冬菇的菌絲體含有較高的脂溶性維生素E，菌絲體干粉具有顯著免疫活性，其發(fā)酵液和菌絲體含有必需氨基酸、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，可以開發(fā)為新型營(yíng)養(yǎng)飲料、保健藥、食品添加劑等，然而用作抗菌劑的研究鮮有報(bào)道。本研究篩選到一株具有廣譜抗菌活性的野生冬菇0612-9，其發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)S.aureus 的MIC 為1.25 mg/mL，遠(yuǎn)小于辛英姬等研究所得茶樹菇多糖對(duì)S.aureus 的MIC 值(6.25 mg/mL)[12]，表明本研究獲得的野生冬菇對(duì)S.aureus 的抑制作用顯著高于茶樹菇多糖。該野生冬菇的5 倍濃縮發(fā)酵液與鹽酸四環(huán)素活性相近，其抗S.aureus 的相對(duì)效價(jià)為1 806.34 U/mL，具有強(qiáng)抑菌效果，并且在低于60 ℃、pH1.0～6.0 和紫外照射下活性穩(wěn)定，有望開發(fā)成為綠色飼料添加劑，以替代目前存在諸多缺點(diǎn)的獸用抗生素。

在微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)物的研究中，發(fā)酵工藝優(yōu)化起著舉足輕重的作用。目前，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化生物反應(yīng)過(guò)程的報(bào)道較多，大部分取得較好的優(yōu)化結(jié)果。本研究采用響應(yīng)面法與正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了野生冬菇0612-9 的發(fā)酵工藝，獲得了最佳工藝參數(shù)。由于野生冬菇0612-9 菌體生物量與抗菌活性物質(zhì)的積累不一致，主因素碳、氮源和礦物質(zhì)的使用量直接影響到兩者的增幅，因此本研究結(jié)果對(duì)在該抗菌物質(zhì)放到生產(chǎn)中降低發(fā)酵成本和提高生產(chǎn)效率具有指導(dǎo)意義。

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