冷青文，李志遠(yuǎn)，魯海富，金云云，王靜梅，剡根強(qiáng)

(石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae，MO)是引起綿羊支原體肺炎(又稱綿羊傳染性胸膜肺炎)的一種慢性呼吸道傳染病的病原，主要危害1 月齡～3 月齡的羔羊，以咳嗽、氣喘、漸進(jìn)性消瘦和肺間質(zhì)的慢性增生性炎癥為特征。最早由Mackay等從患肺腺瘤的綿羊體內(nèi)分離得到[1]，Cottew 在澳大利亞患病綿羊的肺臟中也發(fā)現(xiàn)了該支原體[2]。隨后的研究表明，MO 在世界許多國家和地區(qū)均有流行，是危害養(yǎng)羊業(yè)的主要病原之一。其主要感染綿羊和山羊等家養(yǎng)動(dòng)物，而引起野生動(dòng)物致病的病例鮮有報(bào)道[3-4]。本研究從某動(dòng)物園疑似肺炎的盤羊體內(nèi)采集病料樣品，并對(duì)病原體進(jìn)行分離鑒定，查明該盤羊群發(fā)病的原因?yàn)镸O 感染，為進(jìn)一步有效防治該病提供臨床資料。

1 材料和方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 MO 參考株Y-98購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；絲狀支原體山羊亞種(M.mycoides subsp.Capri，Mmc)和MO-141 分離株由本學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。改良Hayflick's 液體培養(yǎng)基成分為：25%酵母浸出液1 mL，1 % HLH 混合液48 mL，牛心汁30 mL，豬血清20 mL，50 %葡萄糖2 mL，0.2%DNA 1 mL，5%醋酸鉈0.5 mL，青霉素200 U/mL，0.4%酚紅0.3 mL；改良固體培養(yǎng)基成分為：25 %酵母浸出液10 mL，牛心汁70 mL，胰蛋白胨1 g，瓊脂粉1.4 g，牛血清20 mL，5 %醋酸鉈0.5 mL，青霉素200 U/mL。從石河子某羊場(chǎng)選取體質(zhì)量相近的8 只60 日齡健康綿羊作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 病料樣品的采集 新疆某動(dòng)物園飼養(yǎng)的盤羊發(fā)生呼吸道疾病，初步診斷為肺炎，使用抗生素治療效果不佳。無菌采集病死盤羊的病變肺組織1 份；采集與疑似病羊同群的28 只盤羊的鼻腔棉拭子各1 份。

1.3 病原分離 取部分肺組織樣品按1∶10 加入液體培養(yǎng)基研磨成乳劑，3 000 r/min 離心10 min，以0.45 μm 濾器過濾上清液。取0.2 mL 濾液接種于3 mL改良Hayflick's 液體培養(yǎng)基以10 倍遞減稀釋至10-7，于37 ℃5 %～10 % CO2培養(yǎng)。將鼻腔棉拭子在液體培養(yǎng)基中反復(fù)擠壓后，取其浸出液按上述方法進(jìn)行過濾、稀釋和培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d～7 d 后，當(dāng)培養(yǎng)基由紅色變?yōu)槌赛S色時(shí)，取液體培養(yǎng)物接種于改良固體培養(yǎng)基，于37 ℃5 %～10 % CO2、濕度為80 %的條件下培養(yǎng)7 d。在低倍顯微鏡下挑取單個(gè)特征明顯的菌落接種于液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待培養(yǎng)物顏色明顯變化后再次接種固體培養(yǎng)基。重復(fù)操作3次，得到分離純化的培養(yǎng)物。

1.4 病原鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 將純化的液體培養(yǎng)物離心濃縮后涂片，經(jīng)堿性復(fù)紅染色，利用油鏡觀察菌體形態(tài)。取純化的液體培養(yǎng)物0.1 mL 接種于改良固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同1.3，5 d～7 d 后置低倍鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.4.2 菌落Dienes 染色 將Dienes 染液滴加到菌落生長較好的改良固體培養(yǎng)平板表面，靜置數(shù)分鐘，棄去染液，并用生理鹽水洗凈平板表面的染色液。利用低倍鏡觀察菌落中心顏色是否為藍(lán)色。

1.4.3 理化特性檢驗(yàn) 根據(jù)OIE 相關(guān)文獻(xiàn)[5]及國內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[6]要求設(shè)定檢驗(yàn)項(xiàng)目，進(jìn)行理化特性檢驗(yàn)，同時(shí)以MO-141 株為陽性對(duì)照。檢驗(yàn)項(xiàng)目包括水解精氨酸、葡萄糖降解、氯化四氮唑還原試驗(yàn)、尿素分解、美藍(lán)還原及紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)。

1.4.4 PCR 鑒定 提取肺組織樣品濾液和各鼻腔棉拭子浸出液中的病原菌DNA 以及各對(duì)照菌株的DNA，置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)[7]的方法，以制備的病原菌基因組DNA 為模板，利用MO 特異性引物PF：5'-AGATA CGGCCCAGACTCCTAC-3' 和PR：5'-CTTCGCCTAT TGGTGTTCTTC-3'進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)以MO 參考株Y-98、Mmc 和MO-141 株的DNA 為對(duì)照。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 人工感染試驗(yàn) 將經(jīng)過培養(yǎng)基培養(yǎng)和PCR 鑒定均為MO 陰性的8 只綿羊隨機(jī)平均分為2 組，分別作為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組氣管注射3 mL/只純化的液體培養(yǎng)物(107CCU/mL～108CCU/mL)，對(duì)照組氣管注射3 mL/只生理鹽水，并分群飼養(yǎng)。人工感染后每日上午定時(shí)測(cè)量體溫，觀察臨床表現(xiàn)。至第35 d 迫殺試驗(yàn)羊，檢查肺臟病變情況，取病變肺組織樣品接種于改良Hayflick's 液體培養(yǎng)基，5 %CO237 ℃培養(yǎng)7 d，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；另取部分肺組織樣品以10 %福爾馬林固定，制作石蠟病理切片，HE 染色。

2 結(jié)果

2.1 分離與純化 病料樣品在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d～6 d 后，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化的樣品共有5 份，其中1 份為病變肺組織樣品，4 份為鼻腔棉拭子樣品，經(jīng)純化分別標(biāo)記為M1、M2、M3、M4 和M5，其中M5 來源于病變肺組織，M1～M4 均純化于鼻腔棉拭子樣品。

2.2 形態(tài)觀察及Dienes染色 顯微鏡下顯示菌體呈多形性，紅色，其中桿狀和小球狀較多，桿狀兩極著色。菌落呈透明的針尖狀，表現(xiàn)為圓形、突起，中心無“臍”，無“煎蛋狀”特征(圖1A)。Dienes染色菌落中心呈深藍(lán)色，30 min 內(nèi)不褪色(圖1B)。

2.3 理化特性檢驗(yàn) 5 個(gè)分離菌株均能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、還原氯化四氮唑、還原美藍(lán)；均不水解精氨酸、不水解尿素、不吸附紅細(xì)胞(表1)。

圖1 分離株菌落形態(tài)及其Dienes 染色結(jié)果Fig.1 Shape of isolated colonies and Dienes stained

表1 理化特性檢驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of biochemistry identification test

2.4 PCR檢測(cè) 分別對(duì)提取的32 份DNA 樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，共有7份DNA 樣品擴(kuò)增后獲得長度與預(yù)期相符的目的片段，并且特異性和重復(fù)性好，它們對(duì)應(yīng)的樣品分別為肺臟、Y-98、MO-141 株和4 例鼻腔棉拭子。Mmc 及陰性對(duì)照樣品未擴(kuò)增出特異性目的片段(圖2)。由鼻腔棉拭子擴(kuò)增出的特異性目的片段純化后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明核苷酸序列長度為406 bp。以DNAStar 軟件比較目的片段和GenBank 中相關(guān)支原體的序列，該序列與MO 標(biāo)準(zhǔn)株Y-98 同源性為99.9 %，而與Mmc、山羊支原體山羊肺炎亞種(Mccp)、山羊支原體山羊亞種(Mcc)等同源性為81 %。

2.5 人工感染試驗(yàn)

2.5.1 臨床癥狀 在試驗(yàn)過程中，人工感染組2 號(hào)和3 號(hào)羊出現(xiàn)呼吸癥狀，同時(shí)體溫伴隨波浪型變化，體溫最高時(shí)分別升至40.8 ℃和41.2 ℃；1 號(hào)羊體溫變化不明顯，4 號(hào)羊和對(duì)照組的體溫始終在正常范圍內(nèi)。

2.5.2 肺組織樣品的培養(yǎng)鑒定 分別取4 只人工感染羊病變肺組織樣品采用支原體專用培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基顏色變黃呈陽性；克隆純化后的液體培養(yǎng)物經(jīng)PCR 鑒定為MO(圖3)。

圖2 部分樣品PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR identification for some of the samples

圖3 人工感染羊的PCR 檢測(cè)Fig.3 PCR identification of inoculated sheep

2.5.3 病理學(xué)觀察 剖檢4 只試驗(yàn)羊，結(jié)果顯示：3 號(hào)羊肺臟腫大與胸腔粘連，右肺尖葉、心葉實(shí)變明顯、局灶性膿腫、纖維素炎，胸腔有淡黃色積水。顯微鏡觀察肺間質(zhì)增寬，支氣管上皮細(xì)胞和肺泡細(xì)胞增生，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，淋巴細(xì)胞浸潤；部分肺組織肺泡漿液性浸出，肺泡增大、內(nèi)有大量炎性細(xì)胞，肺泡壁網(wǎng)狀細(xì)胞增生(圖4)。其它羊肺臟病理變化不明顯。

圖4 人工感染羊肺臟病理變化Fig.4 The lung of infected sheep

3 討論

多種支原體可以引起羊支原體性肺炎，山羊傳染性胸膜肺炎(CCPP)的病原主要為Mccp，與其密切相關(guān)的其它3 種支原體是絲狀支原體絲狀亞種大菌落型(LC)、Mmc 和Mcc。我國CCPP 的病原主要為Mccp。綿羊偶而也會(huì)攜帶Mccp[8]或出現(xiàn)Mccp 血清陽性反應(yīng)[9]，最近也有Mccp 感染野生動(dòng)物的報(bào)道[5]。MO 主要感染綿羊，有時(shí)也是山羊肺炎的病原[10]。

盤羊是中亞山地特有的高山偶蹄類動(dòng)物，主要分布在青藏高原、蒙新高原以及鄰近地區(qū)的山地。國際瀕危物種公約將其不同亞種分別列為附錄Ⅰ或Ⅱ，我國則將其所有亞種都列為瀕危國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。由于數(shù)量稀少，分布、棲息環(huán)境荒僻，人們很難得到野生盤羊的病例。具有觀賞和保護(hù)價(jià)值的圈養(yǎng)野生動(dòng)物，因其良好的飼養(yǎng)和管理?xiàng)l件，很少發(fā)生傳染性疾病。作為偶發(fā)病例，本研究證明MO是盤羊發(fā)病的病原。調(diào)查結(jié)果顯示發(fā)病盤羊所在地區(qū)為綿羊支原體肺炎高發(fā)區(qū)[11]。MO 主要通過空氣傳播，易感動(dòng)物可以長期帶菌，其對(duì)宿主的致病性與宿主的生活環(huán)境、營養(yǎng)狀況、免疫力等多種因素有關(guān)。根據(jù)流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化等指標(biāo)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室病原檢測(cè)，可以對(duì)綿羊支原體肺炎做出診斷。本研究為野生動(dòng)物保護(hù)和當(dāng)?shù)貏?dòng)物疫病的防控工作提供參考依據(jù)。

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