劉 暢，李 磊，于立新，么宏強(qiáng)，周建華，馬學(xué)恩*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150001)

綿羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenomatosis，OPA)是由綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒(Jaagsiekte retrovirus，JSRV)引起的一種慢性、進(jìn)行性及接觸傳染性的肺臟腫瘤性疾病。JSRV 受體為透明質(zhì)酸酶-2(hyaluronoglucosaminidase 2，Hyal-2)[1]，是JSRV 進(jìn)入細(xì)胞時(shí)所需的受體，當(dāng)JSRV 感染肺上皮細(xì)胞時(shí)，與其受體相結(jié)合，JSRV 會(huì)在肺上皮細(xì)胞內(nèi)高度增殖，可以引發(fā)OPA 的發(fā)生。Hyal-2 是一種糖基磷脂酰肌醇鍵(GPI)錨定蛋白，其以錨定形式存在于細(xì)胞表面，并且在培養(yǎng)的細(xì)胞中表現(xiàn)出較低透明質(zhì)酸酶活性。其不僅局限于肺上皮細(xì)胞膜上，也存在于多種細(xì)胞的質(zhì)膜上[1-2]，因此Hyal-2 受體并不是JSRV感染的唯一決定性因素[2-4]。有研究表明，Hyal-2 不僅可以作為JSRV 及地方鼻腫瘤病毒的受體，而且還是內(nèi)源性JSRV 的受體[5]。NIH 3T3 小鼠成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)烈的接觸抑制作用，所以能夠明確地識(shí)別已發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可以應(yīng)用于JSRV 致瘤機(jī)制的研究。

本研究通過(guò)構(gòu)建含有綿羊Hyal-2 基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Hyal2-HA，轉(zhuǎn)染NIH 3T3 細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)Hyal-2 的NIH 3T3 細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究JSRV 與其受體的相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 NIH 3T3 細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；含有JSRV env 基因的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1-env 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體購(gòu)自Invitrogen 公司；E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要試劑和工具酶 Hin d Ⅲ、XbaⅠ、pMD18-T、T4 DNA Ligase、SYBR?Premix Ex TaqTM、CellAmp?Direct RNA Prep Kit for Real-time RT-PCR 等購(gòu)自TaKaRa 公司；PmlⅠ購(gòu)自NEB 公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)自Invitrogen 公司；G418 購(gòu)自Gibco 公司；抗血細(xì)胞凝集素(HA)單克隆抗體(MAb)購(gòu)自Cell Signaling 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(IgG-HRP)、山羊抗小鼠IgGFITC、超敏發(fā)光試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；cDNA 合成試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及膠回收純化試劑盒等購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中登錄的綿羊Hyal-2 mRNA 序列(NM_001009754)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，將其分為互相重疊的兩段。前一段引物為QHyal2-F：5'-CAAATGACACTGACTTCCTGCAG-3'和QHyal2-R：5'-GAACTCAAACTCATACTGCGCCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為583 bp。后一段引物為HHyal2-F：5'-ACCGG CTGGGCATGTATCCAC-3' 和HHyal2-R：5'-GCTGG GTGAGACCCTTACGA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 195 bp。在目的片段全長(zhǎng)中引入酶切位點(diǎn)及5' 末端融入HA標(biāo)記，上游引物Hyal2-F：5'-CCAAGCTTCCTGCA GCCCCCAGCA-3'(Hin d Ⅲ)，下游引物：Hyal2-R：5'-GCTCTAGATTAGGCGTAATCGGGCACGTCGTA GGGGTACGAAGTCCAGGTGAAG-3'(XbaⅠ)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 485 bp。

根據(jù)GenBank 中登錄的綿羊及小鼠Hyal-2 基因序列，設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)、能夠區(qū)分二者的定量PCR 擴(kuò)增引物。綿羊Hyal-2 基因特異性引物為JDHyal2-F：5'-GGTTTACCACCAGCAACG-3' 和JDHyal2-R：5'-G TAATCGGGCACGTCGTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為450 bp。內(nèi)參基因β-actin 引物為actin-F：5'-CATCCGTAA AGACCTCTATGCCAAC-3' 和actin-R：5'-ATGGAG CCACCGATCCACA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為170 bp。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以綿羊瘤胃組織提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 為模板，利用引物QHyal2-F/QHyal2-R(退火溫度：62 ℃)和HHyal2-F/HHyal2-R(退火溫度：63.7 ℃)，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR 反應(yīng)，分段擴(kuò)增目的片段QH 和HH，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-QH 和pMD-HH。以Pml Ⅰ和XbaⅠ分別進(jìn)行雙酶切，將QH 片段克隆于pMDHH 中構(gòu)建含有完整Hyla-2 基因的重組質(zhì)粒pMDHyal2，并測(cè)序鑒定。

以pMD-Hyal2 為模板，Hyal2-F/Hyal2-R(退火溫度：63.9 ℃)為引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將擴(kuò)增后含有融合HA 標(biāo)記的目的基因進(jìn)行純化，克隆于pcDNA3.1(+)中構(gòu)建含有融合HA 標(biāo)簽序列的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-Hyal2-HA，并測(cè)序鑒定。

1.5 建立穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA的NIH 3T3細(xì)胞系

1.5.1 G418 工作濃度確定 采用終濃度為100 mg/L～900 mg/L G418 加入NIH 3T3 細(xì)胞單層中，于37 ℃5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d 換液一次，共培養(yǎng)15 d～20 d，觀察NIH 3T3 細(xì)胞生長(zhǎng)情況。以細(xì)胞完全死亡的G418 最小濃度為篩選的最佳工作濃度。

1.5.2 穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA 細(xì)胞系的建立 按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)方法，將0.8 μg pcDNA-Hyal2-HA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至90 %～95 %融合的單層NIH 3T3 細(xì)胞中，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)為對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h 后，以最佳工作濃度G418 完全培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。篩選4 d 后，以有限稀釋法傳代于96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，7 d 后挑選含有1 個(gè)細(xì)胞集落的孔，相繼在24 孔板、6 孔板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，以間接免疫熒光(IFA)方法檢測(cè)Hyal2-HA 的表達(dá)情況。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆進(jìn)行連續(xù)3 次克隆純化，使其免疫熒光陽(yáng)性率達(dá)90 %以上。陽(yáng)性克隆以150 mg/L 的G418 擴(kuò)增培養(yǎng)傳代，并于液氮凍存。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA細(xì)胞系的鑒定

1.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 采用試劑盒提取穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA 細(xì)胞系的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，利用特異性引物JDHyal2-F/JDHyal2-R(退火溫度：57 ℃)和內(nèi)參基因引物actin-F/actin-R(退火溫度：57 ℃)，按三步法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)。以未轉(zhuǎn)染的NIH 3T3 細(xì)胞cDNA 為陰性對(duì)照。

1.6.2 IFA 檢測(cè) 將穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA 的細(xì)胞株以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種至24 孔板，同時(shí)以空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為陰性對(duì)照；未做任何處理的NIH 3T3 細(xì)胞作為空白對(duì)照。以HA MAb(1∶100)為一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶500)為二抗，進(jìn)行IFA 檢測(cè)。

1.6.3 Western blot 檢測(cè) 收集表達(dá)Hyal2-HA 的細(xì)胞，經(jīng)RIPA 細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，以HA MAb(1∶1 000)為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP(1∶1 000)為二抗，ECL 發(fā)光顯影進(jìn)行western blot 檢測(cè)。

1.7 JSRV囊膜蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化NIH 3T3-Hyal2-HA細(xì)胞系 按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 說(shuō)明書(shū)方法，將28 μg pcDNA3.1-env 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染NIH 3T3細(xì)胞和NIH 3T3-Hyal2-HA 細(xì)胞系，并設(shè)轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1(+)作為陰性對(duì)照，僅轉(zhuǎn)染試劑作為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染約12 h 后，以PBS 漂洗細(xì)胞3 次，并為細(xì)胞更換完全培養(yǎng)基，隨后每3 d 為細(xì)胞換液并在顯微鏡下觀察其形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pcDNA-Hyal2-HA的構(gòu)建 以綿羊瘤胃組織cDNA 為模板，分段擴(kuò)增Hyal-2 基因。結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物QH 約600 bp 和HH 約1 200 bp，與預(yù)期大小相符(圖略)，并將其克隆至pMD18-T 載體中得到重組質(zhì)粒pMD-QH、pMD-HH。雙酶切處理并連接，經(jīng)鑒定得到含有目的基因Hyla-2 重組質(zhì)粒pMD-Hyal2(圖 略)。以 pMD-Hyal2 為模板，Hyal2-F/Hyal2-R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到融合有HA 標(biāo)簽的Hyal-2 基因，全長(zhǎng)約為1 500 bp，與預(yù)期大小相符(圖略)。將目的基因與pcDNA3.1(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-Hyal2-HA。陽(yáng)性克隆進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果顯示，目的基因的讀碼框架和插入方向正確，與預(yù)期相符(圖略)。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA細(xì)胞系的建立及鑒定 將重組質(zhì)粒pcDNA-Hyal2-HA 轉(zhuǎn)染NIH 3T3 細(xì)胞，以G418 最佳工作濃度300 mg/L 進(jìn)行篩選。挑取G418抗性細(xì)胞克隆，經(jīng)3 次有限稀釋法純化后，建立了穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA 細(xì)胞系NIH 3T3-Hyal2-HA。

提取NIH 3T3 細(xì)胞及第15 代的NIH 3T3-Hayl2-HA 細(xì)胞系總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行三步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以β-actin cDNA 作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量，檢測(cè)目的基因是否穩(wěn)定高表達(dá)。結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染的NIH 3T3 細(xì)胞未檢測(cè)到綿羊Hyal-2 cDNA，而NIH 3T3-Hayl2-HA 細(xì)胞系檢測(cè)到較高的綿羊Hyal-2 cDNA 表達(dá)量(圖1)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)Hyal2-HA 在NIH 3T3-Hyal2-HA 中的表達(dá)Fig.1 Identification of Hyal2-HA protein expressed in NIH 3T3-Hyal2-HA cells by real-time PCR

將NIH 3T3-Hyal2-HA 細(xì)胞裂解后提取總蛋白，以抗HA MAb 進(jìn)行western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，在55 ku 處可見(jiàn)特異性條帶，大小與預(yù)期相符，而未轉(zhuǎn)染的NIH 3T3 細(xì)胞空白對(duì)照未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)條帶(圖2)。

以HA MAb 為一抗，羊抗鼠IgG-FITC 為二抗，分別對(duì)NIH 3T3-Hayl2-HA 細(xì)胞系和NIH 3T3 細(xì)胞進(jìn)行IFA 檢測(cè)，結(jié)果顯示，NIH 3T3-Hayl2-HA 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第一代即能呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光，并且熒光主要集中于細(xì)胞膜上，在胞核及胞質(zhì)中僅見(jiàn)微弱熒光，對(duì)照細(xì)胞則無(wú)熒光(圖3A)。將該細(xì)胞克隆傳代至15 代，其仍能夠穩(wěn)定表達(dá)Hyal2-HA 蛋白(圖3B)，而且陽(yáng)性細(xì)胞率在可見(jiàn)范圍內(nèi)為100 %(圖3C)。

圖2 Western blot 檢測(cè)Hyal2-HA 在NIH 3T3-Hyal2-HA 中的表達(dá)Fig.2 Identification of Hyal2-HA protein expressed in NIH 3T3-Hyal2-HA cells by western blot

圖3 IFA 檢測(cè)Hyal2-HA 在NIH 3T3 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Identification of Hyal2-HA expressed in NIH 3T3 cells by IFA

2.3 JSRV囊膜蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化NIH 3T3-Hyal2-HA細(xì)胞系 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-env 轉(zhuǎn)染3 周后，在顯微鏡下分別觀察NIH 3T3 細(xì)胞和NIH 3T3-Hyal2-HA細(xì)胞系的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，JSRV 囊膜蛋白可以誘導(dǎo)NIH 3T3 細(xì)胞形成典型的轉(zhuǎn)化聚積灶(圖4A)；而JSRV 囊膜蛋白對(duì)NIH 3T3-Hyal2-HA 細(xì)胞系無(wú)影響，并未使其形成轉(zhuǎn)化聚積灶(圖4B)。表明在NIH 3T3 細(xì)胞中，綿羊Hyal-2 蛋白抑制了JSRV囊膜蛋白的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化作用。

圖4 JSRV 囊膜蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化NIH 3T3 細(xì)胞及NIH 3T3-Hyal2-HA 細(xì)胞系Fig.4 Envelope protein of JSRV induced NIH 3T3 cells and NIH 3T3-Hyal2-HA cell line

3 討論

近年來(lái)研究表明，在NIH 3T3 細(xì)胞中，JSRV囊膜蛋白(Env)與鼠Hyal-2 不結(jié)合，并且其不表達(dá)鼠源RON/Stk，過(guò)表達(dá)鼠Hyal-2 對(duì)JSRV Env 轉(zhuǎn)化能力無(wú)影響[6]；而在表達(dá)人Hyal-2 的NIH 3T3 細(xì)胞中，JSRV Env 的轉(zhuǎn)化能力卻受到了明顯的抑制[7]。由此推斷，在NIH 3T3 細(xì)胞中，不同種屬來(lái)源的Hyal-2對(duì)JSRV Env 轉(zhuǎn)化能力的影響存在差異。因此，只有在表達(dá)綿羊Hyal-2 的NIH 3T3 細(xì)胞中，才能更具體的了解綿羊Hyal-2 對(duì)JSRV Env 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化能力的影響。

NIH 3T3 小鼠成纖維細(xì)胞自身表達(dá)鼠源Hyal-2，并且綿羊與小鼠Hyal-2 的氨基酸序列同源性較高，因此需要特異性較好、無(wú)種屬間交叉免疫反應(yīng)的MAb 才能夠?qū)⒍咴诘鞍姿缴霞右詤^(qū)分。目前市場(chǎng)上商品化的主要是Hyal-2 多克隆抗體，不同種屬間存在交叉免疫反應(yīng)，不適用于區(qū)分不同種屬來(lái)源的Hyal-2。本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)目的蛋白功能影響較小，只有9 個(gè)氨基酸的HA 標(biāo)簽，融合表達(dá)于Hyal-2 的C 端，構(gòu)建了含有綿羊Hyal-2 基因編碼區(qū)全長(zhǎng)的pcDNA-Hyal2-HA 真核表達(dá)重組質(zhì)粒；利用該重組質(zhì)粒建立了穩(wěn)定表達(dá)JSRV 受體綿羊Hyal-2 的NIH 3T3 細(xì)胞系NIH 3T3-Hyal2-HA。并且證明，在該細(xì)胞系中，綿羊Hyal-2 蛋白抑制了JSRV 囊膜蛋白誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化NIH 3T3 細(xì)胞，這與人Hyal-2 蛋白的作用相同[7]，但其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。該細(xì)胞系的建立為進(jìn)一步研究JSRV 與其受體的相互作用致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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