秦玉寅，王雪峰，韋華冕，王 帥，林躍智，杜 承，王曉鈞，周建華*，胡建軍

(1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 塔里木盆地生物資源保護(hù)利用省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001；3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾 843300)

馬傳染性貧血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)弱毒疫苗是首例慢病毒弱毒疫苗，該疫苗可以抵抗同源或異源致病性病毒株的攻擊[1]。前期研究顯示，EIAV 弱毒疫苗株經(jīng)過(guò)減毒后病毒基因組發(fā)生了多位點(diǎn)、多形態(tài)和高頻度的變異[2-4]。弱毒疫苗在基因構(gòu)成上，特別是gp90 基因處于一種復(fù)雜的基因構(gòu)成狀態(tài)，是一個(gè)由在基因水平上與親本強(qiáng)毒存在明顯差異，同時(shí)個(gè)體間也存在一定差異的多種疫苗株個(gè)體構(gòu)成的準(zhǔn)種混合體[5-7]。初步體內(nèi)和體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，準(zhǔn)種狀態(tài)的弱毒疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)要明顯優(yōu)于基于單一疫苗株基因構(gòu)建的感染性克隆病毒株[5]。為進(jìn)一步驗(yàn)證EIAV 弱毒疫苗的基因組及免疫原多態(tài)性是疫苗誘導(dǎo)免疫保護(hù)的關(guān)鍵因素，需要構(gòu)建一系列不同gp90 基因的弱毒疫苗株感染性克隆，通過(guò)比較單一感染性克隆衍生病毒與多種感染性克隆衍生病毒混合免疫馬匹后誘導(dǎo)免疫保護(hù)效果差異，進(jìn)而驗(yàn)證EIAV 弱毒疫苗gp90多樣性與免疫保護(hù)的關(guān)系。

本研究從EIAV 驢胎皮膚(FDD)細(xì)胞弱毒疫苗(EIAVFDDV13)中擴(kuò)增了與感染性克隆pLGFD3-8(來(lái)源于EIAVFDDV13)存在4.8 %差異的gp90 基因，并將其替換pLGFD3-8 中的gp90 基因，構(gòu)建了感染性克隆pLGFD13-15，并拯救出衍生病毒。兩種衍生病毒的比較對(duì)EIAV 致弱機(jī)制和免疫誘導(dǎo)機(jī)理的研究具有一定的意義。

1 材料和方法

1.1 病毒株、載體、細(xì)胞 FDD 細(xì)胞、馬單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞(eMDM)、EIAVFDDV13、EIAV 感染性克隆質(zhì)粒pLGFD3-8 均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所慢病毒研究組提供。

1.2 主要試劑 LipofectamineTM2000、M-MLV 購(gòu)自Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche 公司；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶等購(gòu)自TaKaRa 公司；Plasmid Mini KitⅠ購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas 公司；抗p26 單克隆抗體(MAb)由本實(shí)驗(yàn)制備并保存；DyLight 800 標(biāo)記羊抗鼠的IgG 購(gòu)自SIGMA 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì) 利用DNAStar、Mega5.0 等軟件對(duì)獲得的gp90 核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，以感染性克隆pLGFD3-8(GU385361)為參考序列設(shè)計(jì)引物(表1)。引物由Invitrogen 公司合成。

表1 構(gòu)建感染性克隆所用引物Table 1 Primers designed for construction of infectious clone

1.4 病毒RNA提取與gp90基因擴(kuò)增 按Qiamp Viral RNA Mini Kit 說(shuō)明書方法提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA 為模板，利用引物90-1/90-2 擴(kuò)增完整gp90 基因。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min?；厥漳康钠?，并克隆于pMD18-T 載體中，由Invitrogen 公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 感染性克隆pLGFD3-8中g(shù)p90基因的替換以pLGFD3-8 為模板，利用引物P1/P2 擴(kuò)增P1P2 片段，以P3/P4 為引物擴(kuò)增P3P4 片段，P1P2 片段與gp90 克隆(F13-15)進(jìn)行融合PCR 擴(kuò)增P1-90 片段，將P1-90 與P3P4 片段再進(jìn)行融合PCR 擴(kuò)增P1P4 片段，利用NcoⅠ和NruⅠ酶切P1P4 片段后替換到pLGFD3-8 構(gòu)建感染性克隆pLGFD13-15。經(jīng)PCR 鑒定后，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.6 p LGFD13-15的轉(zhuǎn)染和傳代 按照LipofectamineTM2000 說(shuō)明書操作方法將pLGFD13-15 轉(zhuǎn)染80 %～90 %的FDD 細(xì)胞中，5 d 后取細(xì)胞上清液接種單層FDD 細(xì)胞。8 d～10 d 收獲病毒液，-70 ℃凍存。取病毒液接種FDD 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)8 d～10 d，凍融細(xì)胞培養(yǎng)物兩次，離心收取病毒液。病毒在FDD 細(xì)胞盲傳3 代獲得衍生病毒vpLGFD13-15。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞和病毒顆粒蛋白 將vpLGFD13-15 感染的細(xì)胞和上清液超速離心(20 000 g，2 h)后，分別以p26 MAb(1∶10 000)為一抗，DyLight 800 標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶10 000)為二抗，采用ODYSSEY 激光掃描成像系統(tǒng)掃描成像，進(jìn)行western blot 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。以感染性克隆pLGFD3-8 衍生病毒作為陽(yáng)性對(duì)照[5]。

1.8 培養(yǎng)物中病毒粒子的電鏡觀察 在病毒感染FDD 細(xì)胞后，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收取細(xì)胞制備電鏡切片，利用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.9 病毒體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)分析 取等量的vpLGFD3-8和vpLGFD13-15 接種到鋪有FDD 細(xì)胞和eMDM 的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃孵育1 h 后棄去病毒液，PBS 洗滌2 次，加入細(xì)胞維持液200 μL。每隔24 h分別收取試驗(yàn)組和對(duì)照組3 個(gè)孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，于-80 ℃保存。重復(fù)3 次，采用反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定病毒TCID50[5]。

2 結(jié)果

2.1 EIAVFDDV13的gp90基因多樣性比較 通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增EIAVFDDV13完整的gp90 基因，經(jīng)克隆后隨機(jī)選取15 個(gè)陽(yáng)性克隆用于測(cè)序和分析。以pLGFD3-8 的gp90 序列作為參考序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)，對(duì)各序列推導(dǎo)氨基酸差異率分析表明，不同克隆間的平均差異是2.7 %(0～5.8 %)，變異主要集中在已鑒定的主要變異區(qū)[1]，其中有2 個(gè)克隆在V8 區(qū)缺失了3 個(gè)氨基酸，這些變異引起部分克隆在V5、V6 和V8 區(qū)糖基化位點(diǎn)發(fā)生改變。其中克隆F13-15 與感染性克隆pLGFD3-8 的gp90 差異率為4.8 %，二者之間存在21 個(gè)在變位點(diǎn)，這些位點(diǎn)集中在V3-V7 區(qū)，F(xiàn)13-15 在V5 區(qū)的244 位點(diǎn)丟失了糖基化位點(diǎn)，而在位于V6 區(qū)的278 位點(diǎn)新增了一個(gè)糖基化位點(diǎn)(圖2)。本研究將選擇F13-15 克隆替換到pLGFD3-8，構(gòu)建不同的gp90 感染性克隆。

圖1 基于EIAVFDDV13不同病毒株gp90 基因推導(dǎo)氨基酸繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Polygenetic analysis of gp90 amino acid sequences from different clones of EIAVFDDV13

2.2 感染性克隆pLGFD13-15的構(gòu)建 通過(guò)PCR擴(kuò)增pLGFD3-8 的P1P2 片段、P3P4 片段和F13-15的gp90 片段，利用融合PCR 的方法獲得P1P4 片段。利用NcoⅠ和NruⅠ將感染性克隆pLGFD3-8 的gp90 片段替換為 F13-15，獲得感染性克隆pLGFD13-15，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符。

2.3 Western blot檢測(cè)vp LGFD13-15病毒蛋白將pLGFD13-15 轉(zhuǎn)染FDD 后盲傳3 代，利用獲得的第3 代vpLGFD13-15 感染FDD 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)8 d后分別收獲細(xì)胞和上清液。以vpLGFD3-8 作為陽(yáng)性對(duì)照。Western blot 分析顯示，在感染的細(xì)胞及上清液中均能夠檢測(cè)到病毒蛋白p26 特異性條帶(圖3)。

2.4 病毒粒子的電鏡觀察 衍生病毒vpLGFD13-15轉(zhuǎn)染FDD 細(xì)胞后，取上清液在FDD 細(xì)胞中盲傳3代，透射電鏡觀察到大量球狀病毒顆粒，具有錐形核心，為典型的EIAV 粒子(圖4)，表明vpLGFD13-15 對(duì)FDD 細(xì)胞具有感染性，可以在FDD 細(xì)胞良好的增殖。

2.5 病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)測(cè)定 以相同病毒含量的細(xì)胞培養(yǎng)上清液分別接種FDD 細(xì)胞和eMDM，比較vpLGFD3-8 和vpLGFD13-15 在不同細(xì)胞中的復(fù)制能力的差異。結(jié)果表明，與vpLGFD3-8 相比，vpLGFD13-15 在FDD 細(xì)胞中能夠更快速的復(fù)制，在接種病毒后2 d～4 d 內(nèi)，其細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒含量明顯高于vpLGFD3-8；但在培養(yǎng)后期，vpLGFD3-8的含量明顯上升，而vpLGFD13-15 的含量卻趨于平穩(wěn)。兩種病毒在eMDM 中的復(fù)制呈現(xiàn)出不同的趨勢(shì)：相比vpLGFD3-8，vpLGFD13-15 在eMDM 中的復(fù)制明顯遲緩(圖5)。

圖2 EIAVFDDV13gp90 推導(dǎo)氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of gp90 deduced amino acid sequences between pLGFD13-15 and pLGFD3-8

圖3 衍生病毒感染細(xì)胞及上清液超離產(chǎn)物的western blot 結(jié)果Fig.3 Western blot analysis of virus infected cell precipitate and the culture supernatant

圖4 衍生病毒感染FDD 細(xì)胞的電鏡觀察Fig.4 Electron micrograph of EIAV derived from vpLGFD13-15 in FDD cell

3 討論

圖5 病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線Fig.5 Replication of vpLGFD3-8 and vpLGFD13-15 in cells of FDD and eMDM

EIAV 疫苗經(jīng)過(guò)體外長(zhǎng)期無(wú)宿主特異性免疫壓力下的傳代培養(yǎng)，病毒基因組積累了大量的變異[2]。對(duì)EIAVFDDV13的測(cè)序結(jié)果表明，EIAV 弱毒疫苗并非由相對(duì)單一的病毒種群構(gòu)成，而是一個(gè)能夠形成多個(gè)分支，具有準(zhǔn)種特性的病毒種群[3]。gp90 不僅是EIAV 的主要變異區(qū)域，也是病毒最重要的免疫原，其包含豐富的免疫識(shí)別表位(包括3 個(gè)主要中和表位和9 個(gè)高活性的Th 表位等)[8-10]。本研究對(duì)EIAVFDDV13完整gp90 基因擴(kuò)增后隨機(jī)挑選15 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，序列分析顯示，不同克隆間的差異在0～5.8 %，變異主要集中的已鑒定的高變區(qū)域，有的變異引起糖基化位點(diǎn)的改變。體內(nèi)試驗(yàn)表明，基于單一克隆構(gòu)成的疫苗株衍生病毒株vpLGFD3-8 對(duì)馬匹的免疫效果要明顯弱于親本疫苗株EIAVFDDV13[2]。表明中國(guó)EIAV 弱毒疫苗的這種“多克隆構(gòu)成”與其誘導(dǎo)良好的免疫保護(hù)有著重要的相關(guān)性。將構(gòu)建的含有不同gp90 變異體的弱毒疫苗感染性克隆，通過(guò)比較單一感染性克隆和多個(gè)感染性克隆病毒組合對(duì)馬匹的免疫保護(hù)效果，進(jìn)一步驗(yàn)證上述的假設(shè)是否成立。

本研究將來(lái)源于EIAVFDDV13的gp90 變異體替換到感染性克隆pLGFD3-8，構(gòu)建了嵌合感染性克隆pLGFD13-15。pLGFD13-15 與pLGFD3-8 在gp90 的差異是4.8 %，有21 個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異和2 個(gè)糖基化位點(diǎn)的改變。比較二者的衍生病毒在FDD 細(xì)胞和eMDM 細(xì)胞中的復(fù)制情況顯示，vpLGFD13-15 在FDD 細(xì)胞的復(fù)制能力要明顯優(yōu)于vpLGFD3-8，而在eMDM 細(xì)胞中卻表現(xiàn)出了相反的情況，表明EIAV囊膜蛋白的差異與病毒對(duì)不同靶細(xì)胞的感染或復(fù)制能力相關(guān)。結(jié)果表明EIAVFDDV13中含有不同gp90 基因的病毒在體外生物學(xué)特性存在差異，而這些生物學(xué)差異可能是EIAV 準(zhǔn)種構(gòu)成的特點(diǎn)之一。但要研究這兩株病毒在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)特點(diǎn)及其差異性，還需進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。本研究為進(jìn)一步研究EIAV 弱毒疫苗基因多樣性的生物學(xué)意義提供了一株重要的感染性克隆。

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