李文輝，關(guān)立崢，張 芳，王 晶，盧昆鵬，施建忠，鄧國華，陳化蘭

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

流感病毒(Influenza virus)屬于正粘病毒科流感病毒屬，基因組由8 個單股負(fù)鏈RNA 節(jié)段組成，根據(jù)流感病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的差異，A 型流感病毒分為16 種HA 亞型和9 種NA 亞型[1]。根據(jù)致病性高低可以分為高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。H5N2亞型流感病毒高低兩種致病性均存在，主要存在于遷徙的鳥類，最近也從家禽和哺乳動物體內(nèi)分離得到。相關(guān)研究顯示，在家禽市場中，H5N2 出現(xiàn)持續(xù)的重組變異[2]。2012 年在西藏的雞群中就分離到一株天然的H9N2 和H5N1 重組的H5N2 亞型流感病毒[3]。近期報道表明，對水禽長期使用某種藥物會導(dǎo)致H5N2 亞型流感病毒發(fā)生突變進(jìn)而更易于感染人類[4]。因此本研究對2012 年我國湖南省環(huán)境中分離到的一株H5N2 亞型流感病毒進(jìn)行了全基因組進(jìn)化分析及對家禽和小鼠的感染性的研究，初步評價該類H5N2 亞型流感病毒對家禽及哺乳動物的感染情況，為H5N2 亞型生物學(xué)特性的研究提供數(shù)據(jù)支持，進(jìn)而對H5N2 亞型流感病毒的監(jiān)測和防控發(fā)出預(yù)警。

1 材料和方法

1.1 病毒株和實(shí)驗(yàn)動物 H5N2 病毒分離株來自2012 年湖南省鴨群環(huán)境中的正常水樣監(jiān)測樣品，由國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離保存，病毒命名為：EN/HuN/S3794/2012(H5N2)(EN/HuN/794/12)。10 日齡～11 日齡SPF 雞胚及4 周齡SPF 雞、SPF 鴨均購自本研究所實(shí)驗(yàn)動物中心；6 周齡雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2 主要試劑 RNA 提取試劑TRIzol LS 及反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)試劑盒購自Invitrogen 公司；DNA 聚合酶、dNTPs 和DNA Marker DL2000 均購自TaKaRa 公司；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；BigDye Terminator測序試劑盒3.1 version 購自ABI 公司；BigDye Seqque-ncing clean Up kit 購自MCLAB 公司。

1.3 病毒增殖及雞胚半數(shù)感染量(EID50)測定 將流感病毒分離株經(jīng)有限稀釋后利用10 日齡～11 日齡SPF 雞胚純化3 代，進(jìn)行病毒增殖后保存。將其按10 倍倍比稀釋，各稀釋度經(jīng)尿囊腔接種4 枚10 日齡～11 日齡SPF 雞胚，37 ℃培養(yǎng)，48 h 后收集尿囊液測其血凝價，根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算EID50。

1.4 全基因組序列分析

1.4.1 核酸的提取及RT-PCR 擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)[5]的方法提取病毒RNA，根據(jù)GenBank 中H5 亞型流感病毒各基因片段序列選擇同源性最高的區(qū)域設(shè)計(jì)PCR 引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，以瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，并利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化。

1.4.2 序列測定及分析 采用BigDye Terminator 試劑進(jìn)行測序產(chǎn)物純化，于ABI 測序儀中測序；利用DNAStar 軟件中SeqMan 程序進(jìn)行序列拼接，利用MegAlign 進(jìn)行同源性比較；應(yīng)用Mega5 進(jìn)行進(jìn)化樹的繪制及進(jìn)化分析。

1.5 抗原性差異分析 將該株流感病毒制成標(biāo)準(zhǔn)的四單位血凝抗原，按照WHO 頒布的標(biāo)準(zhǔn)的HA-HI 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行交叉HA-HI 試驗(yàn)的檢測[6]，測定病毒對異源病毒血清的交叉血凝抑制效價。具體病毒株名稱見表1。

表1 抗原性分析選用的病毒株Table 1 Isolate antigenic analysis with reference strains

1.6 動物感染性試驗(yàn)

1.6.1 對SPF 雞和SPF 鴨的感染性試驗(yàn) 以106EID50/100 μL 病毒鼻腔感染4 周齡SPF 雞和SPF 鴨各11只，以接種PBS 作為對照，于負(fù)壓隔離器中飼養(yǎng)。感染72 h 后各迫殺3 只，并采集腦、氣管、胸腺和肝臟等11 種組織臟器。剩余實(shí)驗(yàn)動物感染后連續(xù)10 d 采集咽喉拭子和泄殖腔拭子，接種11 日齡雞胚進(jìn)行組織臟器和拭子病毒含量的滴定；感染后14 d采血，檢測血清轉(zhuǎn)陽情況。

1.6.2 對BALB/c 小鼠的感染性試驗(yàn) 將病毒稀釋到終濃度為106EID50/50 μL，鼻腔感染50 μL，感染組8 只，對照組5 只接種PBS；72 h 后迫殺3 只，采集腦、脾、腎、肺和鼻甲骨5 種臟器勻漿后8 000 r/min，離心3 min 后收集上清液，接種11 日齡雞胚進(jìn)行組織病毒含量的滴定。剩余小鼠連續(xù)觀察14 d，每天記錄小鼠體重變化及死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 全基因組序列分析

2.1.1 核苷酸序列分析 將測序后的全基因組序列經(jīng)DNAStar 軟件中的SeqMan 軟件拼接校正，通過Blast 比對顯示：各基因片段與2011 年本實(shí)驗(yàn)室分離到的一株DK/HuN/S4120/2011(H5N2)(DK/HuN/120/11)高度同源(表2)。EN/HuN/794/12 與DK/HuN/120/11 的8 個基因片段同源性均很高，在97.4 %～99.3 %之間。

序列分析顯示，在HA 序列中不存在多個連續(xù)堿性氨基酸，不具有HPAIV 的典型結(jié)構(gòu)特征。HA蛋白的潛在糖基化位點(diǎn)分別為26NNS28、27NST29、39NVT41、181NNT183、302NNS304、500NGT502和559NGS561。以H3 亞型HA 為模板比較影響流感病毒HA 受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸序列表明，影響HA 受體結(jié)合特異性的位點(diǎn)有121S、133S、134A、139G、186E、188T、189K、193N、210I、218K、222Q、223S、224G、251E、315T、388K 和497R。這些位點(diǎn)中，除了210I 為人型受體氨基酸外，其余位置均未發(fā)生變異。NA 無頸部缺失，NA 的潛在糖基化位點(diǎn)分別為45NHT47、63NWS65、123NGT125、177NAT179、379NWS381；內(nèi)部基因中，NS 基因的80～84位未出現(xiàn)大部分H5N1 流感病毒出現(xiàn)的缺失現(xiàn)象，PB1 和PB2 基因分別發(fā)生N375S 和T339K 的點(diǎn)突變。

表2 EN/HuN/794/12 株與DK/HuN/120/11 株的全基因組核苷酸同源性比較Table 2 Homology of whole genomics between EN/HuN/794/12 and DK/HuN/120/11 viruses

2.1.2 遺傳進(jìn)化分析 將EN/HuN/794/12 的8 基因節(jié)段分別同H5 亞型流感病毒各分支的參考序列進(jìn)行比較，并構(gòu)建各基因片段的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。結(jié)果顯示，HA 的進(jìn)化樹中，EN/HuN/794/12 與DK/HuN/120/11、WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 在同一個分支上，為同一祖先進(jìn)化而來，與H5N1 亞型分支、H5N2 歐亞系分支及H5N2 北美分支均差距較遠(yuǎn)，同源性與Korea/L60-2 分支為76.7%～82.9 %；其同源性最高的DK/HuN/120/11 病毒株與亞洲其它地區(qū)出現(xiàn)的H5N2 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，文獻(xiàn)報道稱DK/HuN/120/11 可以作為湖南省洞庭湖地區(qū)H5N2 亞型流感病毒來源的祖先[7]。

NA 的進(jìn)化樹中，EN/HuN/794/12 與WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 位于同一小分支上，并且同源性大于95 %，它們與DK/HuN/120/11 來源于同一祖先，而與其它HA N2 亞型流感病毒親緣關(guān)系均很遠(yuǎn)。

內(nèi)部基因中，除M 基因沒有與DK/HuN/120/11在一個小分支上，但同源性也高于95 %，其余的片段均與DK/HuN/120/11 高度同源，所有的內(nèi)部基因片段與各分支H5N1 亞型AIV 及歐亞和北美系的H5N2 亞型AIV 的內(nèi)部基因片段進(jìn)化關(guān)系均較遠(yuǎn)，表明內(nèi)部基因來源單一，不存在重組變異。

圖1 EN/HuN/794/12 株的基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of EN/HuN/794/12

2.2 抗原性差異分析 通過進(jìn)行HA-HI 試驗(yàn)，利用本實(shí)驗(yàn)室保存的H5 亞型AIV 參考病毒株的標(biāo)準(zhǔn)抗原和對應(yīng)的陽性血清以及本研究的分離株進(jìn)行抗原性分析。結(jié)果顯示，EN/HuN/S3794/2012(H5N2)與目前使用的Clade2.3.4 疫苗株、Clade7 疫苗株和(Clade2.3.2.C)Re-6 疫苗株之間抗原差異較大(表3)。

2.3 對SPF雞和SPF鴨的感染性試驗(yàn) 以106EID50/100 μL 劑量病毒感染SPF 雞和SPF 鴨后，均無明顯臨床癥狀，病毒滴定顯示咽喉拭子、泄殖腔及臟器中均未檢測到病毒，表明病毒感染SPF 雞和SPF 鴨后不能通過呼吸道和消化道排毒，在雞和鴨體內(nèi)不能有效復(fù)制；感染后14 d 血清檢測結(jié)果為陰性。結(jié)果表明該病毒對SPF 雞和SPF 鴨的感染性較弱，不具備在雞群和鴨群間發(fā)生有效傳播的能力。

2.4 對BALB/c小鼠的感染性試驗(yàn) 以106EID50/50 μL 病毒鼻腔感染BALB/c 小鼠后小鼠無明顯的臨床癥狀，14 d 內(nèi)體重也未發(fā)生明顯變化。臟器滴定結(jié)果顯示，該病毒只能在肺臟內(nèi)復(fù)制，不能引起全身復(fù)制(圖2)，結(jié)果表明該病毒對小鼠的感染性較弱。

表3 抗原性差異分析結(jié)果Table 3 Antigenic differences analysis by HA-HI tests

圖2 感染3 d 后小鼠臟器滴定結(jié)果Fig.2 Virus titration in mice organs on day 3 post inoculation

3 討論

H5N2 亞型流感病毒在野鳥中通常呈低致病性，但在其感染家禽后，可能變異為HPAIV[8-9]。LPAIV有可能為HPAIV 提供某些基因片段，間接導(dǎo)致AIV的暴發(fā)[10]。本研究EN/HuN/794/12 與DK/HuN/120/11、WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 具有共同祖先，而這些病毒與亞洲流行的其他H5 亞型流感病毒進(jìn)化關(guān)系很遠(yuǎn)。其對SPF 雞和SPF 鴨感染能力均很低，對小鼠也為低滴度感染，但也應(yīng)該加強(qiáng)重視，防止病毒適應(yīng)宿主。EN/HuN/794/12 株與DK/HuN/120/11 同樣來自湖南省洞庭湖區(qū)域，此區(qū)域是候鳥遷徙的重要棲息地，病毒在鳥類體內(nèi)經(jīng)過長期進(jìn)化可能發(fā)生基因突變，也可能通過候鳥的遷徙導(dǎo)致該類型病毒發(fā)生基因重組和替換，產(chǎn)生新亞型流感病毒；另外具有同一來源的WB/Korea/L60-2/08 和EWC/Vietnam/8/07 都是從亞洲的野鳥體內(nèi)分離得到，表明在亞洲可能存在通過野鳥遷徙路徑攜帶該病毒。該病毒對家禽感染性較弱，但能夠存在于家禽體內(nèi)，其種類繁多，數(shù)量巨大，監(jiān)察監(jiān)管較為困難，一旦暴發(fā)疫情很難控制，所以存在著潛在的危害性。總之，本研究為LPAIV 特別是H5N2 亞型流感病毒的科研工作提供數(shù)據(jù)支持，加強(qiáng)有關(guān)方面對該類病毒的重視程度，為該類病毒的流行病學(xué)監(jiān)測采用可行性方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為可能對家禽及人類造成的危害發(fā)出早期預(yù)警。

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