聶小倩 王艷艷 熊開(kāi)和 黃應(yīng)平 方艷芬

（三峽大學(xué)三峽地區(qū)地質(zhì)災(zāi)害與生態(tài)環(huán)境湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北宜昌 443002）

制藥廢水具有排放量大、污染物種類(lèi)繁多、有毒有機(jī)物含量高等特點(diǎn).隨著水污染處理技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的處理技術(shù)，其中由于生物降解處理工業(yè)廢水中的有毒污染物效果明顯，現(xiàn)已成為降解有毒有機(jī)污染物主要方法之一［1］.篩選出對(duì)工業(yè)廢水中各類(lèi)不同的有毒有機(jī)污染物均有較強(qiáng)降解能力的微生物，可以提高生物處理法對(duì)廢水中有毒類(lèi)有機(jī)污染物的處理效果.利用微生物降解的方法處理含高濃度有機(jī)污染物的工業(yè)廢水具有處理成本低、經(jīng)濟(jì)效益好、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn).因此研究高效降解微生物處理工業(yè)廢水具有重要的意義［2－5］.

本文研究對(duì)象為宜昌某制藥廠排放的制藥廢水以其廢水為碳、氮源，通過(guò)選擇性富集，馴化培養(yǎng)，劃線分離純化和篩選等方法，分別從三峽大學(xué)求索溪、三峽大學(xué)教師公寓旁池塘、三峽大學(xué)校醫(yī)院旁的池塘的活性污泥中分離得到降解能力最強(qiáng)的菌株.然后，進(jìn)一步利用單因素優(yōu)化法得到該菌株降解制藥廢水的最適條件.

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 菌種及制藥廢水來(lái)源

原始的菌種來(lái)自①三峽大學(xué)校醫(yī)院旁池塘的污泥；②三峽大學(xué)求索溪的污泥；③三峽大學(xué)教師公寓附近池塘的污泥.

制藥廢水：該廢水為農(nóng)藥制品所需原料（甘氨酸）車(chē)間排放的廢水，該廢水主要含有氯化銨和甘氨酸等初始原料，無(wú)色澄清透明、有刺鼻的氨水味道、廢水顯堿性，pH為9.0，COD為8 580mg／L，BOD5為2 360 mg／L，其兩者比值約為0.3，表明用微生物氧化處理要較好.取樣回來(lái)后，將廢水和污泥曝氣靜置24h，制藥廢水使用前用0.45μm濾膜過(guò)濾除菌.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

牛肉膏（BR）；蛋白胨（BR）；葡萄糖（AR）；KH2PO4（AR）；K2HPO4（AR）；無(wú)水CaCl2（AR）；MnSO4·H2O（AR）；NH4NO3（AR）；H2SO4（AR）.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

SW－CJ－2G型（名牌之星）雙人凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），電子分析天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司），高壓滅菌鍋，COD回流裝置，XTL光學(xué)顯微鏡（上海昌安電子科技有限公司），pHa－P數(shù)字式酸度計(jì)（梅特勒－托利多儀器上海有限公司），金怡智能生化培養(yǎng)箱（上海新菌醫(yī)療機(jī)械制造有限公司），PR－ZDYC－1水浴恒溫振蕩搖床（上海普瑞斯儀器有限公司），TG16－W型高速微量離心機(jī)（長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司）.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 微生物降解制藥廢水能力的測(cè)定

COD值反映了水體受還原性物質(zhì)污染的程度［6］.本實(shí)驗(yàn)采用重鉻酸鉀法測(cè)定COD值［7］.

本實(shí)驗(yàn)采用跟蹤C(jī)OD值的方法來(lái)測(cè)定菌株培養(yǎng)過(guò)程中制藥廢水的COD，通過(guò)計(jì)算制藥廢水COD的降解率（%）來(lái)表示菌株對(duì)制藥廢水的降解能力.

式中，COD0為實(shí)驗(yàn)前制藥廢水的COD值；CODn為實(shí)驗(yàn)一定時(shí)間后制藥廢水的COD值.

1.4.2 菌株的富集

配制富集培養(yǎng)基［8］并調(diào)節(jié)pH至7.0，用紗布包扎好后置于高壓滅菌鍋中滅菌30min.待培養(yǎng)基冷卻后，將其分裝于250mL的錐形瓶中.每個(gè)錐形瓶中加入35mL富集培養(yǎng)基，再加入曝氣靜置24h的制藥廢水10mL，最后分別加入3處污泥各5mL（共計(jì)50 mL），置于搖床中，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d.

1.4.3 菌株的馴化

菌株的馴化分為3組：A制藥廢水和三峽大學(xué)求索溪污泥；B制藥廢水和三峽大學(xué)校醫(yī)院旁池塘污泥；C制藥廢水和三峽大學(xué)教師公寓旁池塘污泥；每組做3個(gè)平行樣.第1次馴化，在9個(gè)250mL的錐形瓶中分別分裝35mL已滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基［8］，加入5mL富集培養(yǎng)基.在無(wú)菌條件下將10mL制藥廢水分別加入到9個(gè)250mL的錐形瓶中，培養(yǎng)液組后總體積均為50mL.第2、3次馴化的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基體積分別為25mL和15mL，制藥廢水體積分別為20mL和30mL，總體積保持為50mL.以3d為一個(gè)周期，共進(jìn)行3個(gè)周期的馴化，每個(gè)周期開(kāi)始前及結(jié)束后，均測(cè)定每瓶培養(yǎng)液的COD值，再計(jì)算其降解率.每個(gè)周期后選對(duì)制藥廢水降解率最高的培養(yǎng)液作為下一次的馴化的接種源.

1.4.4 菌株的分離與純化

經(jīng)過(guò)了3個(gè)周期的馴化后，取制藥廢水降解率最高的培養(yǎng)液在含有制藥廢水的無(wú)機(jī)鹽平板上涂布（廢水與無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液體積比為3∶2），倒置于恒溫培養(yǎng)箱30℃恒溫培養(yǎng).挑取單菌落于上述無(wú)機(jī)鹽平板上反復(fù)劃線分離，最終得到純的單菌落.將得到的純菌落用滅菌過(guò)的接種環(huán)接種于含有制藥廢水的牛肉膏蛋白胨［9］斜面上，4℃冰箱貯藏.

1.4.5 菌株的初步鑒定

觀察無(wú)機(jī)鹽平板上單菌落的菌落培養(yǎng)特征并記錄在冊(cè).于無(wú)菌條件下，用接種環(huán)少量挑取單菌落涂玻片，進(jìn)行美藍(lán)染色及革蘭氏染色［10］.于顯微鏡下觀察染色結(jié)果，初步鑒定菌株的形態(tài)及結(jié)構(gòu)特征.

1.4.6 菌株降解廢水的最適條件研究

取出貯藏的菌落，挑取菌落制成菌株懸液，在無(wú)菌的條件下將菌株懸液接種到混有制藥廢水的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，保持培養(yǎng)液總體積為50mL.采用單因素優(yōu)化法，即每次實(shí)驗(yàn)確定一個(gè)因子為變量（底物體積分?jǐn)?shù)，溫度和pH），其他的因子保持不變，在搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)3d后，測(cè)定COD值，計(jì)算其對(duì)制藥廢水的降解率，確定出最適的降解條件［11－12］.

1.4.7 制藥廢水在最適降解條件下的降解曲線

在最適條件下，以總體積的20%的接種量接入到已滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，置于搖床中恒溫振蕩培養(yǎng).每隔10h取一次培養(yǎng)液，測(cè)定其中的殘留COD，依據(jù)前后COD的變化來(lái)計(jì)算其降解率，繪制最適條件下的制藥廢水降解曲線［13］.

2 結(jié)果與討論

2.1 馴化結(jié)果

2.1.1 第1次馴化

取含有微生物的富集培養(yǎng)基5mL加入到含有10mL制藥廢水的培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液總體積為50 mL），調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH為7.0，置于搖床中30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d.測(cè)定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液的COD值，計(jì)算微生物對(duì)廢水的降解率.3個(gè)樣點(diǎn)污泥中的微生物的第1次馴化結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 第1次馴化結(jié)果

從表1中可以得出，3個(gè)取樣地點(diǎn)微生物對(duì)制藥廢水降解能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋呵笏飨拘ａt(yī)院＞教師公寓.求索溪污泥中的微生物對(duì)廢水的降解能力最好，平均降解率可達(dá)到39.3%.因此，選取降解率最高的A2培養(yǎng)液作為第2次馴化的接種源.

2.1.2 第2次馴化

取5mL第1次馴化中的A2培養(yǎng)液進(jìn)行第2次馴化，結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 第2次馴化結(jié)果

通過(guò)表2可以看出，經(jīng)過(guò)第2次馴化后，微生物對(duì)廢水的平均降解率可達(dá)到65.5%.比較第1次馴化和第2次馴化結(jié)果可得出：經(jīng)過(guò)了兩次馴化后，求索溪底泥中的微生物對(duì)制藥廢水的降解率提高效果明顯，且增幅較大.

2.1.3 第3次馴化

取第2次馴化中降解率最高的制藥廢水的A2培養(yǎng)液進(jìn)行第3次馴化，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 第3次馴化結(jié)果

通過(guò)表3可以看出，第3次馴化后的，求索溪污泥中的微生物對(duì)制藥廢水的平均降解率可達(dá)到78.0%，同前兩次相比依舊有較大幅度的提高.對(duì)第3次降解率最好的A2培養(yǎng)液進(jìn)行一系列的劃線分離，篩選單一純種的菌株，以研究這個(gè)菌株對(duì)制藥廢水降解最好的效果下的最佳降解條件（最佳溫度、pH和底物體積分?jǐn)?shù)）.

2.2 菌株的篩選

在整個(gè)馴化培養(yǎng)過(guò)程中，可以明顯的觀察到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液由原先澄清透明的狀態(tài)逐漸變得渾濁不清，而且溶液變?yōu)闇\棕色，有塊狀物懸浮在溶液表面，表明培養(yǎng)液中有微生物在生長(zhǎng).污泥經(jīng)過(guò)含有制藥廢水的富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)、含有制藥廢水的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行馴化、多次劃線分離和純化，最后在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（廢水與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液體積比為3∶2）上分離得到對(duì)制藥廢水具有極強(qiáng)降解能力的優(yōu)良菌株QA.

2.3 菌株的初步鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征

菌落形態(tài)符合細(xì)菌菌落的典型特征，其菌落濕潤(rùn)、光滑、半透明、粘稠、易挑取、質(zhì)地均勻，以及菌落正反面或邊緣中心的顏色與中央部位的顏色一致，呈乳白色.其菌落大小為0.96cm.

2.3.2 菌體形態(tài)特征

菌體呈球狀，單個(gè)、成雙或多個(gè)聚集排列.

2.3.3 染色特征

其革蘭氏染色結(jié)果為革蘭氏陰性.

2.4 菌株降解廢水的最優(yōu)條件研究

2.4.1 溫度對(duì)降解的影響

在無(wú)菌條件下，取5mL QA菌懸液接種到含有30mL制藥廢水的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液總體積為50mL），調(diào)節(jié)pH為7.0.置于不同的溫度梯度（20、25、28、30、32、35和40℃）條件下恒溫振蕩培養(yǎng)3d，每個(gè)溫度條件下做3個(gè)平行樣品.分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后培養(yǎng)液的COD，根據(jù)實(shí)驗(yàn)前后的COD值得出QA菌株在不同溫度條件下對(duì)制藥廢水的降解率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.

圖1 溫度對(duì)菌株降解廢水的影響

由圖1可知，20℃時(shí)QA菌株對(duì)制藥廢水的降解率為36.7%，隨著溫度的逐漸升高，降解率也在逐步升高.當(dāng)溫度達(dá)到30℃時(shí)，降解率達(dá)到78.3%.當(dāng)溫度繼續(xù)升高超過(guò)30℃時(shí)，廢水降解率逐漸下降，至40℃時(shí)，降解率下降到最低值26.9%.因此30℃是QA菌株降解制藥廢水的最佳降解溫度條件.這是因?yàn)槲⑸锝到鈴U水涉及到生物體內(nèi)的一系列生物化學(xué)反應(yīng)，而這些生物化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行是離不開(kāi)生物酶的作用的.由于生物酶具有最適的反應(yīng)溫度，在此溫度下生物酶的反應(yīng)活性最高，因此當(dāng)溫度低于最適溫度，酶的活性沒(méi)有完全激活，隨著溫度的逐漸上升，酶的活性逐漸提高.當(dāng)溫度超過(guò)了最適溫度，生物酶就逐漸地失活、變性，其催化效率就下降了，相應(yīng)的降解率也會(huì)逐漸下降［14］.

2.4.2 pH對(duì)降解的影響

在無(wú)菌條件下，取5mL QA菌懸液接種到含有30mL制藥廢水的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中（培養(yǎng)液總體積為50mL），設(shè)置pH梯度為5、6、6.5、7、7.5、8、9.將培養(yǎng)液置于恒溫?fù)u床30℃振蕩培養(yǎng)3d，每個(gè)pH條件下做3個(gè)平行樣品.分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后培養(yǎng)液的COD，根據(jù)實(shí)驗(yàn)前后的COD值得出QA菌株在不同pH條件下對(duì)制藥廢水的降解率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示.

圖2 pH對(duì)菌株降解廢水的影響

由圖2可知，在pH為5時(shí)，廢水降解率為50.2%，當(dāng)培養(yǎng)液pH為7時(shí)，廢水的降解率達(dá)到最大值79.1.在pH＝5～7范圍內(nèi)，QA菌株對(duì)制藥廢水的降解率隨著pH的升高而逐漸增大，pH為7時(shí)降解率最大.pH從7到9這個(gè)區(qū)間隨著pH升高，QA菌株對(duì)制藥廢水的降解率逐漸下降，至pH為9時(shí)，降解率降到了最低值42.8%.說(shuō)明pH為7時(shí)是QA菌株對(duì)廢水的降解率的最優(yōu)條件.這是因?yàn)閜H也是影響生物酶活性的一個(gè)重要因素.pH值的改變會(huì)影響生物酶活性中心的必須基團(tuán)的解離程度，同時(shí)也影響底物和輔酶的解離程度，從而影響酶分子對(duì)底物分子的結(jié)合和催化，當(dāng)pH過(guò)小或過(guò)大時(shí)都會(huì)使酶蛋白變性而失活［15］.因此，pH為7時(shí)是此菌株的最適pH.

2.4.3 底物體積分?jǐn)?shù)對(duì)降解的影響

在無(wú)菌條件下，取5mL QA菌懸液接種到含有制藥廢水（10、15、20、25、30、35、40mL）的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中（培養(yǎng)液總體積為50mL），調(diào)節(jié)pH至7.0.此時(shí)培養(yǎng)液底物體積分?jǐn)?shù)依次分別為200、300、400、500、600、700和800mL／L.將培養(yǎng)液置于搖床內(nèi)30℃恒溫振蕩培養(yǎng)3d，每個(gè)底物體積分?jǐn)?shù)條件做3個(gè)平行樣品.分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后培養(yǎng)液的COD，計(jì)算QA菌株在不同底物體積分?jǐn)?shù)條件下對(duì)廢水的降解率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 底物體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株降解廢水的影響

由圖3可知，在底物體積分?jǐn)?shù)從200mL／L逐漸增大到600mL／L的過(guò)程中，QA菌株對(duì)制藥廢水的降解率也在逐漸增大，從200mL／L時(shí)的38.1%增大到了600mL／L的77.7%.當(dāng)?shù)孜矬w積分?jǐn)?shù)超過(guò)了600mL／L后，QA菌株對(duì)制藥廢水的降解率急劇的下降.至800mL／L時(shí)，廢水的降解率為1.2%，幾乎為零.因此，制藥廢水體積分?jǐn)?shù)在600mL／L時(shí)是QA菌株的最適底物體積分?jǐn)?shù).當(dāng)廢水體積分?jǐn)?shù)超過(guò)最適體積分?jǐn)?shù)后，廢水對(duì)QA菌株降解的影響很大，這可能與菌株的生長(zhǎng)繁殖受到廢水中各種高含量物質(zhì)的影響有關(guān)［16］.

2.4.4 制藥廢水降解曲線

由上述最適降解條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，30℃，pH為7.0、底物體積分?jǐn)?shù)600mL／L，是QA菌株對(duì)制藥廢水的降解的最適條件，菌株對(duì)廢水的降解效果好.因此在30℃、pH為7.0、底物體積分?jǐn)?shù)為600mL／L的實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定QA菌株制藥廢水的降解曲線.每隔10h測(cè)定培養(yǎng)液的COD值.QA菌株對(duì)制藥廢水降解率隨時(shí)間的變化結(jié)果如圖4所示.

圖4 最適條件下制藥廢水降解曲線

由圖4可以看出，在QA菌株降解制藥廢水的最適條件下，培養(yǎng)的前30h，廢水的降解率不到5.0%，而且基本保持不變.這是由于剛剛接入到制藥廢水的QA菌株需要先適應(yīng)新環(huán)境，即進(jìn)入微生物的停滯期［17］.從30h到70h，QA菌株對(duì)廢水的降解率越來(lái)越大，曲線的斜率也越來(lái)越大，至70h時(shí)，對(duì)廢水的降解率達(dá)到了77.3%.因此，30h到70h之間是QA菌株生長(zhǎng)速率最快、代謝最為旺盛、酶系統(tǒng)最為活躍、細(xì)菌數(shù)量最多的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.70h至90h間，QA菌株對(duì)制藥廢水的降解率基本維持穩(wěn)定，變化幅度很小，即此時(shí)QA菌株進(jìn)入到了穩(wěn)定期.此階段微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物積累達(dá)到了最高峰，營(yíng)養(yǎng)物比例失調(diào)、有毒有害代謝產(chǎn)物積累、pH等理化指標(biāo)已不適宜微生物生長(zhǎng).如果繼續(xù)培養(yǎng)，其生存環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來(lái)越不利、細(xì)胞的分解代謝大于合成代謝，最終會(huì)導(dǎo)致大量細(xì)菌死亡.因此，在QA菌株降解制藥廢水的最適條件下，想讓QA菌株降解某制藥廠廢水效果達(dá)到最佳，最好的時(shí)長(zhǎng)是70h.

3 結(jié) 論

本文采用了微生物目標(biāo)菌株篩選的經(jīng)典方法，即選擇性富集、多次馴化培養(yǎng)、劃線分離與純化得到目的菌株，最后對(duì)目的菌株進(jìn)行鑒定和描述，以及研究其最佳降解條件.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明從求索溪污泥中篩選出的QA菌株對(duì)制藥污水的降解能力最強(qiáng)，最佳降解條件為：溫度為30℃、pH為7，底物體積分?jǐn)?shù)為600 mL／L，其最終降解率為78.6%（80h時(shí)），該降解能力比較強(qiáng)，但還可以對(duì)QA菌株進(jìn)行誘變處理，以進(jìn)一步提高其降解能力.

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