劉艾琳 陳倩 畢穎文 李霞萍 黃宏達 郭潔 江臻穎

·基礎研究·

兔眼低劑量SonoVue超聲造影的可行性及安全性觀察△

劉艾琳 陳倩 畢穎文＊李霞萍＊黃宏達 郭潔 江臻穎

目的 探討不同機械指數(shù)(MI)條件下低劑量SonoVue超聲造影在眼部應用的可行性及對兔眼血-視網(wǎng)膜屏障通透性的影響，評價其在眼部應用的安全性。方法 16只新西蘭白兔分為4組：A組(正常對照)、B組(MI=0.1)、C組(MI=0.3)、D組(MI=0.1聯(lián)合瞬間爆破)，造影劑劑量為1.2 mL。由QontraXt軟件獲得兔眼球壁超聲造影的時間-強度曲線，歸納曲線特征，經(jīng)SPSS軟件對曲線的4個參數(shù)值進行統(tǒng)計分析。兔處死后取正常眼及實驗眼做石蠟切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色和白蛋白免疫組織化學染色，觀察視網(wǎng)膜結構及血管滲漏情況。結果 采用低劑量SonoVue超聲造影可實時觀察到球后血管、球壁及眶組織增強至消退的動態(tài)過程。球壁灌注的時間-強度曲線陡直上升后迅速達到峰值，再緩慢下降至造影前水平。B組與C組間4項參數(shù)值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HE染色顯示各組視網(wǎng)膜組織結構均正常。白蛋白免疫組織化學染色法顯示染色均局限于脈絡膜血管及視網(wǎng)膜毛細血管、視盤區(qū)小血管內，血管周圍組織無陽性染色。結論 低劑量SonoVue兔眼超聲造影具有可行性，不同MI值低劑量超聲造影條件下血-視網(wǎng)膜屏障通透性無明顯改變。(中國眼耳鼻喉科雜志，2014，14：353-357)

超聲造影； 眼； 血-視網(wǎng)膜屏障

歷經(jīng)近半個世紀的發(fā)展，超聲造影的臨床應用從最初的心血管領域逐步拓展到腹部臟器、顱腦及甲狀腺、乳腺等淺表器官[1-3]。眼球對于超聲安全性的要求高于全身其他臟器包括胚胎，由于超聲造影對視網(wǎng)膜組織及血管通透性的潛在風險[4-6]，且缺乏充分的動物實驗依據(jù)，眼球并不在SonoVue指南推薦應用的器官之列，眼部超聲造影的應用仍處起步階段[7-8]。

已有研究[9-10]顯示超聲造影對血-腦屏障通透性的影響具有劑量和機械指數(shù)(mechanical index, MI)依賴性，也有實驗[11]證實采用低MI值(0.12)常規(guī)劑量(2.4 mL)眼部超聲造影對兔眼視網(wǎng)膜形態(tài)功能無明顯影響，但不同MI條件下低劑量SonoVue眼部造影成像是否存在差異、是否會對血-視網(wǎng)膜屏障產(chǎn)生不良影響以及瞬間爆破技術眼部應用的安全性仍缺乏實驗證實。本研究的目的就在于觀察不同MI條件下低劑量SonoVue兔眼超聲造影的可行性及對血-視網(wǎng)膜屏障通透性的影響，為眼部超聲造影的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成年新西蘭白兔16只，SPF級(無特定病原體動物)，皆為雄性，體重2～2.5 kg，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(滬)2010-0029。

1.2 超聲造影儀 彩色多普勒超聲診斷儀MyLab90(Esaote, Italy)，配有實時超聲造影匹配成像(contrast tuned imaging, CnTI)技術，線陣探頭LA523，基波頻率為4～13 MHz。

1.3 超聲造影劑 SonoVue(Bracco, Italy)，使用前在干粉劑中加入5 mL生理鹽水，振搖均勻配置成混懸液。

1.4 實驗動物分組 將16只新西蘭白兔隨機分為A、B、C、D 4組，每組4只。A組為正常對照組：未注射超聲造影劑，亦未行超聲檢查。B～D組注射SonoVue行右眼超聲造影檢查：B組MI值設置為0.1；C組MI值為0.3；D組MI初始值為0.1，觀察1 min時采用爆破技術瞬間擊破造影劑微泡，瞬間MI值為1.2。

1.5 超聲造影檢查 B～D組動物肌內注射氯胺酮2 mL(0.1 g)麻醉，探頭水平軸位放置經(jīng)眼瞼掃查右眼。抽取1.2 mL SonoVue，經(jīng)5號頭皮針團注入耳緣靜脈，隨后快速推注5 mL生理鹽水。除MI不同外，整個造影過程中儀器其余設置保持固定，深度30 mm，聚焦20 mm，二維增益80%。實時諧波超聲造影模式：B PEN-M。注射造影劑同時啟動圖像采集，連續(xù)觀察2 min，數(shù)據(jù)保存后導出。經(jīng)QontraXt 3.06(AMID, Italy)軟件進行分析，選取球壁作為感興趣區(qū)(region of interest, ROI)，繪制時間-強度曲線(time-intensity curve, TIC)并得到曲線的4個參數(shù)，即：峰值強度(peak)、達峰時間(time to peak，TP)、曲線尖度(sharpness)和曲線下面積(area under curve，AUC)。

1.6 組織學檢查 超聲造影結束后半小時，采用空氣栓塞法處死16只實驗動物，均取雙側眼球，浸入眼球固定液中固定。經(jīng)脫水、包埋、切片、蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色后行光學顯微鏡檢查。

1.7 免疫組織化學檢查 所有實驗動物各取2張右眼石蠟切片做白蛋白免疫組織化學染色。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇水化后，用檸檬酸抗原修復液煮沸處理1 h。使用羊抗兔白蛋白一抗(ab8940，Abcam，UK)和抗羊HRP-DAB細胞染色試劑盒(CTS019，R&D，US)按產(chǎn)品說明染色，關鍵步驟如下：室溫下胎牛血清白蛋白(BSA)封閉15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入一抗工作液(1∶2 000稀釋)，濕盒4 ℃過夜。依次加入Vial A、Vial B和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染；0.5%鹽酸乙醇分化后封片拍照。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0(IBM, US)軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗，不符合者用非參數(shù)Mann-WhiterU檢驗，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 超聲造影檢查 注入超聲造影劑后，可實時觀察到球后血管回聲明顯增強，球壁隨即迅速增強，球后眶組織逐步均勻增強。球壁開始增強的時間為第5～12秒，平均7.3 s；第7～20秒達峰值，平均14.2 s。達峰后球壁回聲強度逐漸降低，但始終高于眶組織，至2 min時消退完全(圖1)。根據(jù)峰值強度的數(shù)值，QontraXt軟件可生成兔眼超聲造影的三維偽彩色參數(shù)圖(圖2)。

正常球壁的TIC如圖3所示，曲線走向與γ曲線相似：先陡直上升，迅速達到峰值，而后緩慢下降至造影前水平。經(jīng)軟件分析得到曲線4項參數(shù)的平均值(表1)，B組與C組間4項參數(shù)值的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 B組及C組球壁各項灌注參數(shù)的比較

圖1. 正常兔眼超聲造影聲像圖：呈雙幅顯示，左側為二維超聲，右側為造影模式。A：第4秒時球后血管回聲明顯增強；B：第6秒時球壁回聲開始增強；C：第9秒時球后眶組織回聲均勻增強，此時球后血管及球壁回聲達到峰值強度；D：第58秒時球后眶組織回聲明顯減低，且低于球后血管及球壁回聲；E：第60秒時瞬間爆破使大量造影劑微泡在極短時間內破裂，產(chǎn)生強回聲

圖2. 正常兔眼超聲造影三維偽彩色參數(shù)圖：黃色代表峰值強度最高處，橙色次之，黑色峰值強度最低。由淺至深依次為眼瞼、眼內容物、球壁、球后血管及球后眶組織

2.2 組織學檢查 4組實驗動物視網(wǎng)膜HE染色切片光鏡檢查結果如圖4所示：視網(wǎng)膜各層形態(tài)、結構正常，層次清楚，細胞排列規(guī)則。

2.3 免疫組織化學檢查 4組實驗動物白蛋白免疫組織化學檢查結果如圖5所示：脈絡膜呈彌漫性著色。視網(wǎng)膜內毛細血管可見染色。視盤區(qū)血管可見染色，但均局限于血管內，血管周圍組織未見陽性染色。

3 討論

眼球是富含水分的淺表器官，聲衰減少，適合超聲檢查。B超及彩色多普勒超聲能夠顯示眼球的形態(tài)結構及血流動力學信息，卻較難反映血管、球壁及病灶內血流灌注的真實情況[12-13]。超聲造影技術的發(fā)展以及造影劑的更新?lián)Q代，使超聲診斷由單純的形態(tài)學范疇，向功能學診斷方向突破。SonoVue為第2代超聲造影劑，由外殼包裹六氟化硫氣體組成微泡，直徑與血細胞相仿，可隨血液分布全身，正常情況下不會溢出至組織間隙，是一種理想的血池示蹤劑[8,13]。

圖3. 正常兔眼超聲造影TIC：曲線先陡直上升，迅速達到峰值，再緩慢下降至造影前水平

圖4. 光鏡下兔眼視網(wǎng)膜組織HE染色：視網(wǎng)膜各層形態(tài)結構正常，層次清楚，細胞排列規(guī)則。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組。 ×400

圖5. 光鏡下兔眼脈絡膜、視網(wǎng)膜組織白蛋白免疫組織化學染色：脈絡膜彌漫性著色。A：A組；B：B組；C：C組；D：D組；E：視盤區(qū)血管可見染色，但局限于血管內，血管周圍組織未見陽性染色；F：視網(wǎng)膜內毛細血管可見染色；G：陰性對照片，脈絡膜及視網(wǎng)膜組織均未見陽性染色；H：陰性對照片，視盤區(qū)血管。 ×400

本實驗證實了不同MI條件下低劑量SonoVue實時諧波超聲造影的可行性，不僅觀察到兔眼超聲造影的實時動態(tài)過程，還對球壁的灌注情況進行了初步的定量分析。依據(jù)示蹤劑稀釋原理，即在一定濃度范圍內，超聲造影的回聲強度與造影劑微泡的濃度呈正相關，而微泡濃度又與組織灌注的血流量相關[1]。當團注一定量的SonoVue之后，大量微泡在短時間內迅速充盈球后血管，血液中散射體的濃度急速增加，產(chǎn)生強烈的回聲反射，血管回聲迅速增強，球壁回聲亦隨血流灌注而增強。當微泡不斷破裂，造影劑濃度不斷降低，直至完全消失，球壁回聲強度隨之逐漸下降至造影前水平。根據(jù)ROI的回聲強度隨時間變化的關系，運用γ擬合的數(shù)學模型，可建立TIC。該曲線表現(xiàn)為注射造影劑后曲線上升陡直，迅速到達峰值后緩慢下降至基礎水平，符合球壁灌注的動態(tài)變化。

由TIC得出的定量參數(shù)間接反映了超聲造影的動態(tài)過程以及造影劑濃度隨時間變化的規(guī)律。①峰值強度：整個造影過程中ROI回聲強度的最大值，代表了高峰時球壁灌注的造影劑的量。②TP：ROI內出現(xiàn)第1個造影劑微泡至回聲強度達到峰值所需的時間，與球壁的灌注速度相關。③曲線尖度：與球壁灌注和清除的速度有關。④AUC：正比于ROI內的平均血流量，反映了球壁的血流量。據(jù)以往文獻，TIC的曲線形態(tài)與ROI內血管的數(shù)量、結構和分布等有關，灌注參數(shù)受組織深度、造影劑類型和劑量等因素影響[1,3,14-15]。因此，在B組及C組實驗過程中，除MI值不同外，我們保持儀器其他設置與造影劑劑量不變，選取ROI時盡量保持深度、位置、大小一致，使獲得的灌注參數(shù)更具可比性及參考價值，統(tǒng)計結果也顯示4項參數(shù)值與MI值的高低無關?？紤]到各單位超聲儀器、分析軟件、造影劑類型與劑量不盡相同，灌注參數(shù)的絕對值于實際臨床應用可能存在一定局限性，將病變眼與正常眼的血流灌注作對比研究，得出病變時超聲造影的規(guī)律可能更有意義。

D組實驗時采用了瞬間爆破技術，原理為大量造影劑微泡可在高強度聲波的作用下瞬間破裂，產(chǎn)生功率很高的非線性散射回聲，臨床用于持續(xù)滴注法觀察觸發(fā)式成像、團注法觀察病灶再充盈的血供模式及消除造影間歇所剩尚未破裂的造影劑微泡[2,16-17]。由于微泡擊破時可釋放較大能量，產(chǎn)生的氣壓和高溫可能導致微血管壁局部破裂[4-6]，因此該技術的眼部應用安全性需要實驗證實。

眼內組織的特殊性對超聲診斷提出了較高的安全性要求。盡管現(xiàn)有研究[7-8,18-19]證實SonoVue具有很好的安全性，但超聲的熱效應、空化效應、微泡爆破的機械效應仍可能對組織產(chǎn)生不良影響。白蛋白免疫組織化學染色反映了血-視網(wǎng)膜屏障的完整性。正常情況下，脈絡膜血管壁內側因有多孔的膜，血液中的紅細胞和白蛋白可自由滲透到Bruch膜附近的細胞間隙，所以脈絡膜呈彌漫陽性染色。視網(wǎng)膜外屏障限制了脈絡膜中的血漿白蛋白進入視網(wǎng)膜，故而視網(wǎng)膜的白蛋白僅限于血管內[20-22]。本實驗中，視網(wǎng)膜組織學光鏡顯示視網(wǎng)膜各層結構、層次、形態(tài)正常，免疫組織化學結果顯示各組白蛋白局限于脈絡膜層、視網(wǎng)膜毛細血管及視盤血管內，提示了血-視網(wǎng)膜屏障完好?？梢?，采用低MI值、較高MI值、低MI值聯(lián)合瞬間爆破3種不同方式的低劑量SonoVue超聲造影對視網(wǎng)膜結構及血-視網(wǎng)膜屏障均未產(chǎn)生明顯影響。

本研究以兔眼作為研究對象，團注低劑量SonoVue進行實時諧波超聲造影。操作方便，數(shù)據(jù)采集時間短，空間分辨率高，可實時觀察血流灌注，安全、無放射性，是活體狀態(tài)下研究血流動力學較簡便、有效的方法。對于團注大劑量SonoVue或持續(xù)滴注等不常使用的造影方法以及其他類型造影劑的安全性，并未展開研究。超聲造影的安全性，由兔眼推論至人眼，仍需進一步的試驗結果加以證實。

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(本文編輯 諸靜英)

Feasibility and safety of contrast-enhanced ultrasonography with low-dose SonoVue in rabbit eyes

LIUAi-lin,CHENQian,BIYing-wen＊,LIXia-ping＊,HUANGHong-da,GUOJie,JIANGZhen-ying.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：CHEN Qian, Email: qianchen02@hotmail.com

Objective To investigate the feasibility and impact of contrast-enhanced ultrasonography (CEUS) on the permeability of the blood-retinal barrier in rabbits with low-dose SonoVue at different mechanical index (MI). To evaluate its safety of clinical application in ophthalmology. Methods Sixteen New Zealand rabbits were separated into four groups: Group A (normal control), Group B (MI=0.1), Group C (MI=0.3) and Group D (MI=0.1 combining blast). The dose of SonoVue is 1.2 mL. The time-intensity curve (TIC) of ocular wall was obtained by QontraXt software. Four parameters were analyzed by SPSS. Both eyes of each rabbit were subjected to paraffin section after sacrifice. Cellular state and vascular permeability of retina were observed by hematoxylin and eosin (HE) stain and albumin immunohistochemistry (IHC) stain. Results Real-time dynamic images of retrobulbar vessels, ocular wall and orbital tissue were obtained by CEUS with low-dose SonoVue. TIC of ocular wall perfusion surged to the maximum and then decreased to the baseline slowly. No significant differences were detected for the four parameters between Group B and Group C (P>0.05). HE stain showed retinal structures were normal in all groups. Areas of albumin IHC stain were positive inside the choroid vessels, retinal capillaries and optic disc vessels but negative in the adjacent tissues outside the vessels. Conclusions CEUS with low-dose SonoVue is feasible in ophthalmology. No significant differences were observed between the permeability of the blood-retinal barrier at different MI. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2014,14:353-357)

Contrast-enhanced ultrasonography; Ophthalmology; Blood-retinal barrier

復旦大學上海醫(yī)學院青年骨干基金(11L-29)

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科＊病理科 上海 200031

陳倩(Email: qianchen02@hotmail.com)

2014-01-27)