歐陽詩柳，任春梅

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128）

水稻茉莉素受體基因OsCOI1a的克隆與功能研究

歐陽詩柳，任春梅*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128）

將擬南芥茉莉素受體基因COI1在水稻中的同源基因OsCOI1a構(gòu)建到植物雙元表達載體pMYC2，導(dǎo)入擬南芥茉莉素受體突變體coi1-1中，采用Western blot檢測OsCOI1a基因的蛋白表達水平，通過觀察突變體花粉的活性和果莢的育性，檢測OsCOI1a對coi1-1突變體的互補情況，研究OsCOI1a基因的功能。結(jié)果表明，OsCOI1a基因能夠在擬南芥coi1-1突變體中正確表達，并能部分互補雄性不育的表型，表明OsCOI1a基因在水稻茉莉素信號通路中可能起茉莉素受體作用。

水稻；茉莉素；OsCOI1a基因；克隆

茉莉素（Jasmonates，JAs）［1］是來自于亞麻酸的一種新型植物激素，廣泛分布于植物界中［2］。茉莉酸（Jasmonic acid，JA）及其衍生化合物統(tǒng)稱為茉莉素。

有研究表明，茉莉素可以促進果實成熟和營養(yǎng)器官的形成，影響花粉發(fā)育、控制植物的育性、促進葉片衰老和降低植物光合作用，同時它還作為信號分子參與植物的抗性反應(yīng)［3］；誘導(dǎo)大量防衛(wèi)基因的表達，誘導(dǎo)植物揮發(fā)物的改變，釋放出與植物遭受植食性昆蟲侵害后相似的揮發(fā)物［4］；吸引植食性昆蟲的天敵，參與植物的間接防御從而提高植物的抗性［5］。

在茉莉素信號通路中，coronatine insensitive 1（COI1）蛋白作為茉莉素受體起著重要作用［6］，COI1的無功能突變體coi1-1喪失了對茉莉素的所有反應(yīng)，表現(xiàn)為雄性不育［7］。COI1是一種F-box蛋白，能夠與Skpl和Cullin1蛋白形成泛素連接酶復(fù)合體Skp1／Cullin1／F-box protein COI1（SCFCOI1）［8］。

水稻基因組中存在3個COI1的同源基因Os-COI1a、OsCOI1b、OsCOI1c。2006年，OsCOI1基因第1次在水稻中被分離出來［9］（NCBI數(shù)據(jù)庫中登記為AY168645，即OsCOI1a）。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OsCOI1s基因與擬南芥中COI1基因序列有55%的相似度，而OsCOI1s基因之間則有更高的序列相似度，其中OsCOI1a和OsCOI1b的相似度高達82%［10］。在水稻中還鑒定出687種潛在的F-box蛋白［11］，根據(jù)它們的構(gòu)成結(jié)構(gòu)域，歸納入10個亞基中，其中F-box蛋白OsCOI1a（Os01g63420）和OsCOI1b（Os05g37690）與擬南芥中COI1表現(xiàn)出非常相近的直系同源關(guān)系，氨基酸序列的相似度約為75%，OsCOI1a與OsCOI1b的相似度高達89%。因此，推測OsCOI1a和OsCOI1b在水稻中有與COI1在擬南芥中相似的功能，即作為茉莉素受體。

鑒于獲得水稻多突變體的周期較長，并且未見具有明顯表型的單突變體的報道，為了得到遺傳上更有力的證據(jù)，筆者將OsCOI1a構(gòu)建到植物雙元表達載體pMYC2，導(dǎo)入擬南芥茉莉素受體突變體coi1-1，研究水稻OsCOI1a基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為擬南芥coi1-1雜合突變體；Os-COI1a的CDS序列通過PCR技術(shù)從野生型水稻日本晴的cDNA擴增得到；植物雙元載體pMYC2，大腸桿菌E.coli DH5α和農(nóng)桿菌GV3101，均為湖南省作物基因工程重點實驗室植物信號傳導(dǎo)研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 pMYC-OsCOI1a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以野生型水稻日本晴的cDNA為模板，用Fast-Pfu高保真DNA聚合酶和特異性引物p1（5′-TCCCCCGGGATGGGTGGCGAGGTGCCG-3′）和p2（5′-GGAGCTCTCACGC AGGATGCAAGGGGAT-3′），對OsCOI1a的CDS序列進行PCR擴增，切下目標DNA片段后進行回收。同時從pMYC2質(zhì)粒的E.coli DH5α中提取質(zhì)粒，分別用Sma I和Sac I雙酶切回收。

用T4連接酶將酶切純化后的OsCOI1a基因和pMYC2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，進行測序分析，確認質(zhì)粒中帶有的OsCOI1a基因沒有發(fā)生突變以及連接邊界準確無誤。

1.2.2 pMYC-OsCOI1a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌篩選轉(zhuǎn)基因植株

將重組質(zhì)粒pMYC-OsCOI1a用電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中，采取抗生素Kan、Rif篩選，挑選單克隆，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。抽提質(zhì)粒用PCR進行驗證。

擬南芥生長至抽薹后剪去主莖，再生長2個星期使其分化出多個分枝，開花后進行農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化。

挑取驗證正確的單克隆接種于5 mL含50μg／m L Kan、50μg／mL Rif的LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18～24 h。然后大量培養(yǎng)400 m L菌液，收集菌體，用適量的農(nóng)桿菌懸浮液重懸菌體，使OD600在0.8～1.0。

將花缽倒置在裝有轉(zhuǎn)化菌液的燒杯上，使擬南芥花序浸泡在轉(zhuǎn)化菌液中1～2 min；將擬南芥植株平臥在黑暗處保濕1 d，在正常培養(yǎng)條件下生長，1個月后收獲成熟種子。

將上述步驟中成熟種子鋪在含50μg／mL Kan的MS培養(yǎng)基上，篩選出綠色的幼苗。移栽至土壤中，待植物長出蓮座葉后，摘取嫩綠葉片提取DNA。

1.2.3 擬南芥coi1-1背景的鑒定

通過PCR能擴增到OsCOI1a基因片段的植株為轉(zhuǎn)化成功的植株，再將這些植株的DNA引物p1（5′-GGTTCTCTTTAGTCT TTAC-3′）和引物p2（5′-CAGACAACTA TTTCGTTACC-3′）PCR擴增后得到1.5 kb的片段，用Xcm I對PCR產(chǎn)物進行酶切來鑒定轉(zhuǎn)基因植株的coi1-1背景。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR和酶切結(jié)果。

1.2.4 OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株蛋白水平的檢測

稱取0.1 g新鮮材料，提取植物總蛋白。通過Western blot檢測OsCOI1a蛋白的表達水平，SDSPAGE電泳完畢后，將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，分別加入一抗Anti-MYC antibody 1∶1 000雜交液，加入二抗HRPConjugated Goat Anti-Mouse IgG 1∶1 000雜交液雜交。采用凝膠成像儀進行化學(xué)發(fā)光檢測蛋白條帶。

1.2.5 OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株花粉活性和果莢育性的檢測

取1 mL花粉萌發(fā)培養(yǎng)基均勻鋪在載玻片上。培養(yǎng)基凝固后，取新鮮花朵，將雄蕊在培養(yǎng)基上涂抹，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)8～12 h，在體式顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。

觀察coi1-1背景下OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株在開花后角果的伸長結(jié)果情況，判斷是否可育，從而推測OsCOI1a對擬南芥coi1-1的互補情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pMYC-OsCOI1a融合表達載體的構(gòu)建

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，篩選陽性克隆進行PCR鑒定，結(jié)果表明，能夠擴增到約2 000 bp的DNA片段，與OsCOI1a的CDS序列大?。? 893 bp）相近。測序結(jié)果經(jīng)序列比對分析表明與目的序列完全一致，說明成功構(gòu)建了pMYC-OsCOI1a融合表達載體。

2.2 轉(zhuǎn)基因植物的鑒定結(jié)果

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將OsCOI1a轉(zhuǎn)入擬南芥突變體coi1-1雜合體中，在含Kan抗生素的培養(yǎng)基上篩選。提取抗性植株的DNA，先用PCR從抗性植株中擴增OsCOI1a基因片段驗證轉(zhuǎn)基因植株（圖1 -A），結(jié)果表明能夠擴增到約2 000 bp的DNA片段，與OsCOI1a的CDS序列大?。? 893 bp）相近。用引物p1和p2 PCR擴增后得到1.5 kb的片段，用Xcm I對擬南芥DNA的PCR產(chǎn)物進行酶切，圖1-B中1.5 kb的片段中包含了COI1和coi1-1突變體部分的等位基因。在野生型中，Xcm I酶可以識別CCA-9N-TGG片段并切開產(chǎn)生2個片段，但在coi1-1突變體中，Xcm I酶切位點突變，不能切成2個片段。

電泳結(jié)果顯示：6個單株不能被Xcm I酶切，依舊為1.5 kb的條帶（圖1-B）；而野生型背景的可以被Xcm I酶切，產(chǎn)生1.0 kb和0.5 kb的2個條帶。

2.3 轉(zhuǎn)基因植物蛋白水平的檢測結(jié)果

OsCOI1a蛋白的相對分子質(zhì)量大約為7.0× 103，加上pMYC2載體上與OsCOI1a融合表達的6 ×MYC tag以及銜接序列，理論相對分子質(zhì)量約為8.0×103，而實際表觀相對分子質(zhì)量約為9.5×104。Western blot檢測結(jié)果（圖2）顯示，在相對分子質(zhì)量為9.5×104處有明顯的蛋白條帶，而陰性對照在相應(yīng)位置沒有任何條帶，說明OsCOI1a在轉(zhuǎn)基因植株中得到了表達。

圖2OsCOI1a蛋白表達水平表達

2.4 轉(zhuǎn)基因植物花粉活性的檢測結(jié)果

對coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株的花粉活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)野生型Col-0擬南芥的花絲能夠正常伸長，花藥可以正常開裂，花粉也能正常萌發(fā)；擬南芥coi1-1純合突變體花絲不能正常伸長，花藥不能正常開裂，花粉基本不萌發(fā)。coi1-1雜合背景下的OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株表型與野生型Col-0一致；而在coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株中，有的與擬南芥coi1-1純合突變體的表型相同，例如OsCOI1a-2，有的與野生型Col-0的表型接近，如OsCOI1a-30（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因植物花粉活性的檢測

2.5 OsCOI1a基因可部分互補擬南芥coi1-1

觀察coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株的育性，發(fā)現(xiàn)OsCOI1a-30植株在生長后期產(chǎn)生了部分可育的果莢（圖4），說明OsCOI1a基因可部分互補擬南芥coi1-1突變體雄性不育的表型。

圖4 轉(zhuǎn)基因植物的表型

3 討論

在水稻中，茉莉酸信號傳導(dǎo)介導(dǎo)了不同的細胞反應(yīng)，而COI1s在這條響應(yīng)途徑中也是重要的元件之一，有3個非常相近的COI1同源體。在筆者的研究中，OsCOI1a的CDS序列大小為1 893 bp，通過與擬南芥突變體coi1-1的互補試驗證明了水稻中的這些COI1同源體其中的OsCOI1a在JA信號傳導(dǎo)通路中的功能，還包括恢復(fù)了受損的JA信號響應(yīng)如部分育性。對由35S啟動子重組OsCOI1a在coi1-1中完成了超表達，JA信號傳導(dǎo)和育性被恢復(fù)。結(jié)果顯示OsCOI1a的同源體與COI1是直系同源。

通過對轉(zhuǎn)基因擬南芥進行PCR檢測，表明Os-COI1a基因轉(zhuǎn)入了擬南芥coi1-1。用Xcm I對轉(zhuǎn)基因植株DNA的PCR產(chǎn)物進行酶切，鑒定出coi1-1純合背景下的轉(zhuǎn)基因OsCOI1a植株。通過生化試驗證明了OsCOI1a基因表達出目的蛋白。獲得的6株coi1-1純合背景下的OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株，其中有1株的花粉活性檢測出有活性，最終也產(chǎn)生了部分可育的果莢。說明OsCOI1a能部分互補擬南芥coi1-1的表型，與擬南芥COI1具有類似的功能，在水稻中作為茉莉素的受體起重要作用。

另外幾株coi1-1純合背景的OsCOI1a轉(zhuǎn)基因植株沒有產(chǎn)生果莢，可能是由于內(nèi)含子偏愛或者其他原因造成，需要進一步研究。

［1］ Shan XY，Yan JB，Xie DX.Comparison of phytohormone signalingmechanisms［J］.Curr Opin Plant Biol，2012，15：84-91.

［2］ Creelman RA，Mullet JE.Biosynthesis and action of jasmonates in plant［J］.Annual Review of Plant Biology，1997，148（1）：355-381.

［3］ Bishopp A，M?h?nen AP，Helariutta Y.Signs of change：Hormone receptors that regulate plant development［J］. Development，2006，133（10）：1857-1869.

［4］ Acosta IF，F(xiàn)armer EE.Jasmonates，the Arabidopsis book［M］.The Arabidopsis Book8：e0129 doi：10.1199，2010.

［5］ Albom HJ，Thrlings TC，Jones TH，et al.An elicitor of plant volatiles from Beet armyworm oral secretion［J］. Science，1997，276：9-45.

［6］ Reymond P，Weber H，Damond M，et al.Differential gene expression in response tomechanicalwounding and insect feeding in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2000，12（5）：707 -720.

［7］ Katsir L，Chung HS，Koo AJ，et al.Jasmonate signaling：A conserved mechanism of hormone sensing［J］.Curr Opin Plant Biol，2008，11：428-435.

［8］ Feys B，Benedetti CE，Penfold CN，et al.Arabidopsis mutants selected for resistance to the phytotoxin coronatine aremale sterile，insensitive tomethyl jasmonate，and resistant to a bacterial pathogen［J］.Plant Cell，1994，6：751-759.

［9］ Xu L，Liu F，Lechner E，et al.The SCF（COI1）ubiquitine-ligase complexes are required for jasmonate response in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2002，14：1919-1935.

［10］Hu TZ，Wang WP，Cao KM，et al.OsCOI1，a putative COI1 in rice，show MeJA and ABA dependent expression［J］.Progr Biochem Biophys，2006，33：388-393.

［11］Jain M，Nijhawan A，Arora R，et al.F-box proteins in rice.Genome-wide analysis，classification，temporal and spatial gene expression during panicle and seed development，and regulation by lightand abiotic stress［J］.Plant Physiol，2007，143：1467-1483.

［12］Xie DX，F(xiàn)eys BF，James S，et al.COll：An Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility［J］.Science，1998，280：1091-1094.

Cloning and Function of the Rice Jasmonate Receptor Gene OsCOI1a

OUYANGShi-liu，RENChun-mei*

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

We cloned OsCOI1a into the expression vector pMYC2，and transformed it into Arabidopsiscoi1-1mutants.We tested the protein expression levels bywestern blot，observed the activity of pollen and the sterility of siliques in coi1-1 mutants transformed with OsCOI1a，and found out that OsCOI1a could partly complement the phenotype of the sterility of Arabidopsis coi1-1mutants.All these results suggested that OsCOI1a might be a receptor of jasmonates in rice.

Rice；Jasmonate receptor；Gene OsCOI1a；Cloning

Q785

A

1001-5280（2014）04-0337-04 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.04.01

2014 03 05

歐陽詩柳（1987-），女，廣東深圳人，碩士研究生，Email：oyshiliu＠qq.com。*通信作者：任春梅，教授，Email：rencm66＠163.com。

國家自然科學(xué)基金項目（30770195）。