黃磊，楊軍國(guó)，付杰，夏小歡，裘珺琳，陳旭東

（1.紹興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 紹興 312000; 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

一種EGCG單體純化新工藝

黃磊1，楊軍國(guó)2，付杰1，夏小歡1，裘珺琳1，陳旭東1

（1.紹興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 紹興 312000; 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015）

以粗酯型兒茶素為原料，研究采用大孔吸附樹(shù)脂和結(jié)晶純化兒茶素單體EGCG的制備工藝。通過(guò)比較4種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)EGCG的吸附和解吸能力，篩選出最優(yōu)樹(shù)脂AB-8，并考察乙醇梯度洗脫等特性，再經(jīng)過(guò)結(jié)晶析出EGCG晶體。結(jié)果表明：AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)EGCG具有較好的吸附選擇性，通過(guò)10%乙醇洗脫，EGCG產(chǎn)品純度從54.41%提高到了92.65%，得率達(dá)93.38%，結(jié)晶后得純度達(dá)98%以上的EGCG單體。

EGCG；大孔吸附樹(shù)脂；結(jié)晶；純化

茶葉的主要有效成分茶多酚（Tea polyphenols，TP）具有抗腫瘤、抗衰老、抗心腦血管疾病及抑制艾滋病毒（HIV病毒）的作用[1-8]，并能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[9]、防止食物腐敗變質(zhì)，且具備消除異臭、水溶性強(qiáng)等特征，因而被廣泛用于生物保健食品、化妝品、日用化工、輕化工等領(lǐng)域[10]。兒茶素是茶多酚的主體成分，其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）在功效上強(qiáng)于其他兒茶素組分，現(xiàn)已成為兒茶素分離、純化與臨床應(yīng)用研究的焦點(diǎn)，并被美國(guó)列為一種潛在的抗癌藥物進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)[11-13]。我國(guó)的茶葉資源豐富，運(yùn)用現(xiàn)代科技將EGCG開(kāi)發(fā)成天然的保健食品和藥物，具有巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

目前，兒茶素及其氧化產(chǎn)物的分離純化方法主要有高效液相制備色譜法[14-15]、柱層析法[16-21]、高速逆流色譜法（HSCCC）[22-24]等，其處理過(guò)程繁雜，設(shè)備及材料昂貴，產(chǎn)量不高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。樹(shù)脂吸附法提取兒茶素具有高效、安全、無(wú)毒、可持續(xù)生產(chǎn)的特點(diǎn)，較適合大規(guī)模生產(chǎn)。本研究考察4種不同性質(zhì)的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)EGCG的分離純化效果，同時(shí)結(jié)合單次結(jié)晶得到高純度的EGCG單體，從而可為其大規(guī)模生產(chǎn)提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）和表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）系中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，純度≥98%；粗酯型兒茶素樣液參考文獻(xiàn)《大孔吸附樹(shù)脂富集酯型兒茶素》[25]方法自制，其中EGCG純度54.41%，ECG純度14.45%；其余均為色譜純或分析純?cè)噭?。所選大孔吸附樹(shù)脂和脫色樹(shù)脂性質(zhì)特征見(jiàn)表1。

主要儀器和設(shè)備：2795高效液相色譜（美國(guó)Waters公司）；Luna 5u Pheny1-Hexy1色譜柱（250 mm×4.60 mm，5micron，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司）；LGJ-20F真空冷凍干燥機(jī)（歐瑞康萊寶真空設(shè)備（天津）有限公司）；Φ3.5 cm×50 cm玻璃層析柱，Φ8.4 cm×40 cm玻璃層析柱（上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；Beckman Allegra 64R冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）。

表 1 不同大孔吸附樹(shù)脂的理化特性Table 1 Physical and chemical properties of different macroporous adsorptive resins

1.2 靜態(tài)吸附和解吸

樹(shù)脂預(yù)處理：用95%的乙醇溶液浸泡大孔吸附樹(shù)脂24 h，使其充分溶脹。濕法裝柱于玻璃層析柱中，再用95%的乙醇淋洗，待洗出液不渾濁時(shí)改用重蒸水淋洗，洗至無(wú)明顯乙醇?xì)馕都纯桑ù藭r(shí)乙醇濃度低于5%）。準(zhǔn)確稱取HPD826、LX-17、AB-8、XAD-16N樹(shù)脂各30 g（干重），濕法裝柱于φ3.5 cm ×50 cm玻璃層析柱，將酯型兒茶素配制成一定濃度的溶液，以1 BV/h的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，當(dāng)上述樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附飽和后（流出液酯型兒茶素濃度為上樣液濃度的5%時(shí)可以視為吸附飽和），水洗除去部分水溶性雜質(zhì)。配制10%～50%不同梯度的乙醇洗脫液各2 BV，以2 BV/h 流速進(jìn)行洗脫，按每一個(gè)梯度進(jìn)行分段收集，并用HPLC檢測(cè)EGCG和ECG的濃度，方法參照GB/T 21727—2008《固態(tài)速溶茶兒茶素類含量的檢測(cè)方法》測(cè)定。

1.3 樹(shù)脂動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)

1.3.1 動(dòng)態(tài)吸附

選用Φ3.5 cm×50 cm玻璃層析柱，稱取50 g目的樹(shù)脂濕法裝柱，以1 BV/h，2 BV/h，3 BV/h的流速分別進(jìn)樣，實(shí)驗(yàn)時(shí)將酯型兒茶素濃縮液稀釋后上柱，每1 BV分段收集，并用HPLC分析，作出吸附穿透曲線。

1.3.2 動(dòng)態(tài)洗脫

按上述吸附流速使樹(shù)脂吸附飽和，以梯度洗脫所得的最佳濃度乙醇溶液洗脫，洗脫流速1 BV/h，2 BV/h，3BV/h，每1 BV分段收集，HPLC分析每段EGCG濃度，作出洗脫曲線。

1.4 樹(shù)脂中試試驗(yàn)

稱取750 g樹(shù)脂（約1350 ml）濕法裝柱于Φ8.4 cm×40 cm玻璃層析柱中，以最佳吸附速度上樣酯型兒茶素樣液5 L（其中EGCG濃度4.1184 mg/ml，ECG濃度1.2169 mg/ml），再以最佳濃度的乙醇洗脫，每1 BV收集洗脫液，HPLC測(cè)試，計(jì)算EGCG和ECG的得率。

1.5 脫色純化

粗制EGCG單體需進(jìn)一步脫色提高純度，選取一脫色樹(shù)脂進(jìn)脫色后過(guò)柱液45℃真空濃縮，冷凍干燥。準(zhǔn)確稱取經(jīng)脫色后的EGCG單體粗品4 g，用40℃溫水溶解，配制成濃度為40%的溶液，保存于10 ml試管中，放入4℃冰箱中析晶，24 h后0℃，2000 r/min低溫離心20 min，過(guò)濾，用4℃蒸餾水反復(fù)沖洗晶體，低溫真空干燥，HPLC測(cè)定EGCG純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂的篩選

吸附樹(shù)脂由于其極性、孔隙度、孔徑、表面積和是否能形成氫鍵等物理化學(xué)性質(zhì)不同，對(duì)不同物質(zhì)的吸附和選擇性也不相同[26-27]。實(shí)驗(yàn)選擇了4種不同性質(zhì)的樹(shù)脂進(jìn)行分離比較，不同樹(shù)脂對(duì)酯型兒茶素脫除ECG實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知4種樹(shù)脂吸附飽和后，低濃度乙醇均可將EGCG洗脫下來(lái)，其中AB-8樹(shù)脂在10%乙醇洗脫液中未檢測(cè)到ECG，而其他3種都有ECG出現(xiàn)，說(shuō)明AB-8在10%乙醇洗脫條件下對(duì)分離酯型兒茶素中EGCG和ECG有較好的效果。

極性大的化合物一般適于中極性樹(shù)脂分離，而極性小的化合物適于非極性樹(shù)脂分離。其中兒茶素是弱極性物質(zhì)，AB-8作為一款非極性樹(shù)脂，符合這一要求。同時(shí)，需分離物的分子體積大小也是選擇樹(shù)脂型號(hào)的主要因素之一，分子體積較大的化合物應(yīng)選擇較大孔徑的樹(shù)脂?？赡苡捎贏B-8的孔徑、比表面積等因素恰好符合分離EGCG和ECG的要求，因此實(shí)驗(yàn)選擇AB-8作為純化EGCG的目的樹(shù)脂。

洗脫劑的選擇也至關(guān)重要，隨著乙醇濃度的增加，洗脫劑的極性不斷減小。對(duì)于非極性大孔樹(shù)脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力越強(qiáng)，對(duì)于中極性和極性大孔樹(shù)脂則洗脫劑極性越大，洗脫能力越強(qiáng)。10%低濃度的乙醇極性較大，洗脫非極性樹(shù)脂AB-8，其洗脫能力較弱。實(shí)驗(yàn)用10%乙醇洗脫能將EGCG和ECG分離，表明在洗脫劑極性較大的情況下ECG仍吸附牢固不被洗脫，而EGCG與樹(shù)脂之間的作用力已遭到破壞，容易被洗脫，故實(shí)驗(yàn)選擇10%乙醇作為洗脫劑較為合適。

2.2 AB-8動(dòng)態(tài)吸附流速和洗脫流速的優(yōu)化

2.2.1 吸附流速對(duì)樹(shù)脂吸附EGCG吸附量的影響

3種吸附流速條件下EGCG的吸附穿透曲線見(jiàn)圖1。當(dāng)酯型兒茶素水溶液以1 BV/h的流速流經(jīng)50 g（約90 ml）AB-8濕樹(shù)脂的樹(shù)脂床后，在流出液5 BV時(shí)EGCG出現(xiàn)泄漏，可認(rèn)為此時(shí)樹(shù)脂已吸附飽和，最大吸附量為21.7 mg/g。當(dāng)流速為2 BV/h時(shí)，EGCG在4 BV出現(xiàn)泄漏，當(dāng)流速為3 BV/h時(shí)，EGCG在3 BV出現(xiàn)泄漏。兩個(gè)流速的泄漏點(diǎn)均比1 BV/h時(shí)提前。主要因?yàn)榱魉儆绊懭苜|(zhì)向樹(shù)脂表面的擴(kuò)散速度，流速太快，溶質(zhì)分子來(lái)不及擴(kuò)散到樹(shù)脂表面而發(fā)生穿透現(xiàn)象，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1 BV/h時(shí)吸附效果最好。

2.2.2 洗脫流速對(duì)洗脫EGCG效率的影響

按上述飽和吸附量及吸附流速上樣，飽和后用水洗至流出液顏色近無(wú)色或顏色不再變淡時(shí)，用10%乙醇分別以1 BV/h，2 BV/h，3 BV/h流速洗脫，每1 BV分段收集，HPLC分析每段EGCG濃度。結(jié)果如下圖2可知，當(dāng)流速為1 BV/h時(shí)，由于洗脫流速過(guò)小，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。當(dāng)增大流速時(shí)，樹(shù)脂顆粒表面液膜變薄，液膜阻力減小，造成液膜傳質(zhì)系數(shù)增大，傳質(zhì)速率增加。在3 BV/h流速下，單位時(shí)間內(nèi)EGCG的洗脫速率最大，但單位體積內(nèi)EGCG的洗脫量小于2 BV/h時(shí)的洗脫量，綜合考慮選擇2 BV/h的洗脫流速。當(dāng)2 BV/h流速時(shí)，單位體積內(nèi)EGCG的濃度最大，EGCG得率最高，洗脫體積控制在4～5BV即可。

圖 1 不同吸附流速下酯型兒茶素穿透曲線Fig.1 Breakthrough curve of ester catechins under different adsorption velocities注：C0：上樣液酯型兒茶素濃度；C：流出液酯型兒茶素濃度。

圖 2 不同洗脫體積中EGCG含量 Fig.2 Contents of EGCG in different elution volumes

2.3 AB-8樹(shù)脂中試

按最佳工藝參數(shù)上樣，10%乙醇和20%乙醇分別洗脫4 BV，分段收集洗脫液，結(jié)果如下表3。由表可知10%洗脫4個(gè)BV即可將大部分EGCG洗脫，且EGCG得率在90%以上。而20%可大量洗脫ECG，得率在50%左右，此段洗脫液可得到純度較高的ECG單體作為EGCG的副產(chǎn)品。

將洗脫液直接經(jīng)脫色樹(shù)脂ADS-7脫色，直至過(guò)柱液出現(xiàn)顏色即可認(rèn)為色素已滲漏，停止過(guò)柱，過(guò)柱液濃縮，冷凍干燥，得到乳白色純度約92.65%的EGCG單體樣品，50.91%的ECG單體樣品。

2.4 EGCG粗品結(jié)晶純化

結(jié)晶即溶質(zhì)從溶液中析出的過(guò)程，其推動(dòng)力是在一定條件下溶質(zhì)的濃度超過(guò)該溶質(zhì)的溶解度，形成過(guò)飽和溶液。EGCG在水中的溶解度比較大，因此結(jié)晶時(shí)溶質(zhì)需選擇合適的濃度，濃度過(guò)高，溶解困難，需熱水和超聲溶解，實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，且EGCG極不穩(wěn)定，溶解時(shí)溫度過(guò)高易使EGCG發(fā)生氧化，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇將中試所得的粗EGCG樣品配制成40%濃度的溶液，4℃，析晶24 h，離心20 min（0℃，2000 r/mim），除去上清液，將晶體低溫真空干燥，得到白色細(xì)顆粒狀EGCG單體，純度達(dá)98%，圖3為產(chǎn)品的液相色譜圖。

3 結(jié)論

將EGCG純度為54.41%的酯型兒茶素，經(jīng)過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附洗脫，流經(jīng)脫色樹(shù)脂脫色，最后通過(guò)結(jié)晶純化，最終得到純度達(dá)98%的EGCG單體。該過(guò)程只需用到乙醇這一無(wú)毒的有機(jī)溶劑，且10%濃度的乙醇成本低，效果好，因此所得產(chǎn)品綠色環(huán)保，應(yīng)用領(lǐng)域相對(duì)廣泛。

根據(jù)“類似物易吸附類似物”的原則，即一般非極性大孔樹(shù)脂適用于從極性溶液（如水）中吸附非極性有機(jī)物；而極性大孔樹(shù)脂適用于從非極性溶液中吸附極性溶液；中等極性吸附劑，不但能夠從非水介質(zhì)中吸附極性物質(zhì)，同時(shí)他們具有一定的疏水性，也能從極性溶液中吸附非極性物質(zhì)[28]。AB-8作為一種非極性大孔樹(shù)脂，能夠從極性溶液水中吸附弱極性的兒茶素，而且效果好，EGCG吸附量21.7mg/g（樹(shù)脂含水量60%），較同類型樹(shù)脂大[29]，并且在低濃度乙醇洗脫下EGCG和ECG得以有效地分離，得率達(dá)到93.38%。

茶葉中的色素分為水溶性色素和脂溶性色素，實(shí)驗(yàn)中所遇到的色素均為水溶性色素，主要是由兒茶素等多酚類物質(zhì)氧化聚合后的產(chǎn)物組成，包括茶黃素，茶紅素等[30]，對(duì)EGCG產(chǎn)品外觀純度影響很大。茶色素結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子差異大，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中難以被除盡，又極容易形成，因此對(duì)色素形成的機(jī)理、形成條件的控制以及脫色的有效方法有待后續(xù)進(jìn)一步探索研究。

圖 3 結(jié)晶純化后的EGCG液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of EGCG after crystallization

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A New Technology for the Purification of EGCG

HUANG Lei1，YANG Jun-guo2，F(xiàn)U Jie1，XIA Xiao-huan1，QIU Jun-lin1，CHEN Xu-dong1

（1.Shaoxing Institute of Agriculture Sciences，Shaoxing，Zhejiang 312003，China2.Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u'an，F(xiàn)ujian 355015，China）

The way to isolate (-)-epigallocatechin gallate（EGCG）from crude ester catechins with macroporous adsorptive resins in combination with crystallization was investigated in this paper. After comparing the adsorption and desorption capacities among four macroporous adsorptive resins, the optimal resin was chosen, which were further investigated via evaluating the characteristics of gradient elution with ethanol, and finally monomer EGCG was separated by crystallization. The results showed that macroporous adsorptive resins AB-8 possessed the best adsorption selectivity for EGCG. After eluted by 10% ethanol, the purity of EGCG was enhanced from 54.41% to 92.65%, and the yield reached 93.38%. By crystallization, the purity of monomer EGCG was beyond 98%.

EGCG, macroporous adsorptive resin, crystallization, purification

黃磊（1986-），男，碩士研究生，助理農(nóng)藝師，主要從事茶葉深加工、茶樹(shù)栽培。Email: huangleiscott@163.com；