曾美秀(綜述)，蘇 萍(審校)

(浙江蕭山醫(yī)院血液科，杭州 311202)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是B細胞惡性腫瘤，以分泌異常單克隆免疫球蛋白的漿細胞在骨髓內(nèi)大量增生、聚集和免疫功能障礙為特征。傳統(tǒng)的大劑量化療和自體造血干細胞移植可提高患者生存率，新的免疫治療策略中，獨特型疫苗和以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎(chǔ)的免疫治療呈現(xiàn)出有希望的前景，但目前仍難以治愈此疾病。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是一群具有免疫負調(diào)控功能的T細胞亞群，在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止機體對自體同源腫瘤細胞的免疫，導(dǎo)致腫瘤的免疫抑制及免疫逃逸。該文就CD4+CD25+Tregs在MM中的研究進展予以綜述。

1 CD4+CD25+Tregs的生物學特性及作用機制

1.1CD4+CD25+Tregs的生物學特性 CD4+CD25+Tregs是Tregs中的重要群體，占人類和鼠外周血CD4+T細胞的5%～10%，在人類除表達CD25外，還組成性表達叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box protein 3,FOXP3)、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體、CD122、CD103，同時還可分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細胞介素(interleukin,IL)10等[1]。其中，F(xiàn)OXP3特定表達在細胞內(nèi)，是Tregs發(fā)育、活化、發(fā)揮功能的關(guān)鍵，并且不受活化狀態(tài)的影響，被公認為是Tregs的特異性標志，但近期研究發(fā)現(xiàn)許多活化的、不具有抑制功能的細胞也表達FOXP3，且還不清楚是否所有的表達FOXP3的T細胞都具有抑制功能[2]。隨后，研究發(fā)現(xiàn)高表達于非調(diào)節(jié)性T細胞CD127在Tregs低表達，Hartigan-O′Connor等[3]用CD4、CD25、CD127三色抗體標記發(fā)現(xiàn)，人類、鼠及短尾猴外周血存在群體較清晰的CD4+CD25+/highCD127lowT細胞，它們高表達胞內(nèi)FOXP3和CTLA-4，功能分析發(fā)現(xiàn)其具有抑制性、低增殖性和對T細胞受體信號的低反應(yīng)性。CD4+CD25+Tregs可以分為兩大類：一類是天然存在的Treg，它是在胸腺內(nèi)產(chǎn)生并生存在周圍組織中以阻止?jié)撛诘淖陨砻庖叻磻?yīng)；另一類是誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，它的前體細胞也是從胸腺樣組織衍生而來，是在不完全暴露抗原刺激的特定條件下，由幼稚的細胞在體內(nèi)周圍組織中激活后表達CD25分子而轉(zhuǎn)化為 CD4+CD25+Tregs。

CD4+CD25+Tregs具有免疫無能性和免疫抑制性兩大功能特征，前者對IL-2特異性抗原及抗原呈遞細胞的刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)；后者在T細胞受體介導(dǎo)的信號刺激活化后能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖，且這種免疫抑制作用呈現(xiàn)主要組織相容性復(fù)合物非限制性及非抗原特異性。

1.2CD4+CD25+Tregs的作用機制 活化的CD4+CD25+Tregs可以廣泛抑制體內(nèi)多種細胞的增殖，如CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷T細胞、B細胞、DC、單核巨噬細胞和自然殺傷細胞的活性[4]。其以一種主動的方式調(diào)控機體的免疫應(yīng)答，對自身抗原和非己抗原均有較強的免疫抑制作用。目前對Tregs介導(dǎo)的免疫抑制的分子基礎(chǔ)還不是很清楚，認為可能通過以下幾種途徑發(fā)揮作用。

1.2.1細胞接觸的調(diào)節(jié) 研究證實，CD4+CD25+Tregs在體外主要通過細胞-細胞直接接觸的方式介導(dǎo)免疫抑制，而不依賴于細胞因子。中和TGF-β或IL-10作用免疫抑制不受影響，而將CD4+CD25+Tregs與CD4+CD25-反應(yīng)性T細胞用半透膜隔離培養(yǎng)，則不能產(chǎn)生增殖抑制效應(yīng)[5]。有趣的是，活化的CD4+CD25+Tregs經(jīng)多聚甲醛固定后依然能保持抑制活性，提示細胞表面高表達的某種分子可能參與了該免疫抑制作用[6]。隨后的研究表明，CTLA-4可能就是介導(dǎo)這種接觸抑制作用的重要分子[7]，其跨膜分子胞內(nèi)段攜帶酪氨酸抑制基序，與B7配接后傳遞抑制信號，抑制T細胞的增殖和活化。另外，CTLA-4與DC表面的CD80/CD86結(jié)合，通過逆向轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號導(dǎo)致DC內(nèi)的吲哚氨-2，3-雙加氧酶(indole-ammonia-2,3-dioxygenase,IDO)活化，IDO是色氨酸代謝所必需的酶，由于IDO的活化，使游離的色氨酸減少，從而導(dǎo)致T細胞的活化程度降低[8]。此外，CD4+CD25+Tregs在淋巴結(jié)或腫瘤部位亦可通過穿孔素/顆粒酶、Fas/FasL途徑直接殺傷免疫效應(yīng)細胞[9]。

1.2.2細胞因子介導(dǎo)的調(diào)節(jié) 研究表明，CD4+CD25+Tregs可通過分泌TGF-β，抑制CD8+T細胞和自然殺傷細胞對腫瘤的直接殺傷作用。CD8+T細胞表面存在TGF-β受體Ⅱ，與TGF-β結(jié)合后能激活胞內(nèi)片段激酶結(jié)構(gòu)域，隨即發(fā)生磷酸化，可進一步活化細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族，從而啟動相關(guān)基因表達，發(fā)揮抑制活性。Smyth等[10]在小鼠中發(fā)現(xiàn)，無論是體內(nèi)還是體外，Tregs都直接抑制了自然殺傷細胞激活性受體介導(dǎo)的自然殺傷細胞毒性作用，以此削弱對腫瘤細胞的殺傷。IL-10是介導(dǎo)Tregs免疫作用的另一個重要分子，其可通過抑制抗原呈遞細胞有效抑制IL-12的產(chǎn)生，而IL-12是輔助性T細胞分化的關(guān)鍵因子。此外，IL-10還可下調(diào)主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子、單核細胞CD80、CD86和CD28配體的表達及阻止T細胞受體介導(dǎo)的CD4+T細胞的活化。

另外，CD4+CD25+Tregs還可通過在效應(yīng)T細胞活化早期抑制IL-2產(chǎn)生并導(dǎo)致其免疫無能，抑制免疫效應(yīng)細胞向腫瘤微環(huán)境聚集等途徑，介導(dǎo)免疫抑制作用[11]。

2 CD4+CD25+Tregs與MM

2.1MM中Tregs的數(shù)量 近年研究已證實，一些實體性腫瘤(如胃癌、肺癌、肝癌等)中均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Tregs數(shù)量增加,并且Tregs數(shù)量增加程度與腫瘤進展及較差的預(yù)后相關(guān)。MM患者外周血Tregs與MM發(fā)病及預(yù)后亦有關(guān)，初治的MM患者外周血Tregs增多，而在癌前病變階段及緩解期的患者Tregs與正常人相比無顯著差異[12]。Beyer等[13]研究發(fā)現(xiàn)，意義未明單克隆免疫球蛋白血癥、MM患者外周血及骨髓CD4+CD25high/FOXP3+Tregs均較正常對照者顯著增高。韓文敏等[14]通過流式細胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25highCD127lowTregs的結(jié)果與 Beyer等[13]的結(jié)果類似，且Ⅲ期較Ⅰ、Ⅱ期亦顯著升高。對于MM患者 CD4+CD25+Tregs增高的原因，Beyer等[13]通過對細胞表面免疫表型分析發(fā)現(xiàn)，這些增高的Tregs并非因為胸腺產(chǎn)生過多，而是在外周循環(huán)擴增所致，至于是何種或哪些因素導(dǎo)致擴增，未進一步研究。韓文敏等[14]報道，MM患者血清TGF-β表達顯著升高，但與升高的CD4+CD25highCD127lowTregs并無明顯相關(guān)性,提示TGF-β并非MM患者體內(nèi)Tregs增加的重要和唯一因素，可能與IL-10、血管內(nèi)皮生長因子等因素有關(guān)，值得進一步研究。

2.2MM中Tregs的功能 研究表明，MM患者CD4+CD25+Tregs水平顯著增高，那么增高的CD4+CD25+Tregs免疫調(diào)節(jié)功能如何呢?Prabhala等[15]比較MM及正常對照者Tregs抑制可溶性CD3單抗誘導(dǎo)刺激外周血T細胞增殖抑制作用，發(fā)現(xiàn)MM患者Tregs的免疫抑制功能顯著減弱。而Beyer等[13]通過分析MM及正常者來源的高度純化的CD4+CD25highTregs對異基因混合淋巴細胞反應(yīng)及CD3/CD28刺激的T細胞增殖抑制作用發(fā)現(xiàn)，兩組具有相同的抑制功能。分析比較上述研究的不同結(jié)果，可能與試驗中所選擇的方法不同有關(guān)，前者選擇的是外周血單個核細胞中僅除去CD25+的剩余細胞，而后者選擇的是高度純化的CD4+CD25highT細胞，這就排除了包含在外周血單個核細胞中的其他細胞作用的影響。Strauss等[16]報道，頭頸部鱗癌患者外周血單個核細胞及腫瘤浸潤性淋巴細胞中CD4+CD25+/highTregs顯著增高，比較兩種不同來源CD4+CD25highTregs的免疫抑制功能發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性淋巴細胞者對CD3/CD28誘導(dǎo)的免疫增殖抑制作用更強，且這種作用主要由自體T細胞分泌的TGF-β及IL-10介導(dǎo)，而不依賴于細胞接觸，但細胞接觸可對抑制作用進一步增強?？傊琈M作為免疫效應(yīng)細胞的腫瘤，免疫功能異常是導(dǎo)致其發(fā)生、發(fā)展的重要原因和嚴重后果，而MM患者體內(nèi)異常的Tregs構(gòu)成了腫瘤免疫耐受網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，可能是免疫抑制的重要原因。

2.3Tregs與MM免疫治療 近年來，隨著造血干細胞移植以及新藥(如硼替佐米、雷利度胺)的應(yīng)用，MM患者的治療緩解率及生存時間得到了顯著提高，但腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)仍是MM治療的一大困境。在MM新的免疫治療策略中，獨特型疫苗和以DC為基礎(chǔ)的免疫治療成為研究熱點，在大鼠模型研究中顯示，獨特型疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗骨髓瘤的保護性免疫。Hansson等[17]應(yīng)用MM患者自體M蛋白獨特型疫苗聯(lián)合粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子及IL-2免疫Ⅰ～Ⅱ期MM患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分受試者在誘導(dǎo)期均能產(chǎn)生獨特型特異性T細胞反應(yīng)，而CD4+CD25+Tregs顯著升高的患者未產(chǎn)生，因此猜測可能是增高的CD4+CD25+Tregs免疫負調(diào)控抑制了獨特型免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。Tregs與DC之間也存在復(fù)雜的關(guān)系。體外研究中，成熟DC可有效擴增抗原特異性的Tregs，反過來，Tregs能夠抑制未成熟DC的抗原遞呈能力[18]。另外，Tregs的CTLA-4與DC表面 CD80/CD86結(jié)合，誘導(dǎo)DC上IDO的上調(diào)，抑制了T細胞增殖，誘導(dǎo)了T細胞凋亡[8]。熊紅等[19]及丁巖松等[20]報道，應(yīng)用自體骨髓瘤細胞全抗原或M蛋白獨特型疫苗負載DC或糖基化修飾的DC疫苗都可以誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，并殺傷自體骨髓瘤細胞，顯示出明顯的抗骨髓瘤作用。然而相關(guān)臨床試驗效果卻令人大失所望，究其原因，可能是MM患者體內(nèi)增高的Tregs導(dǎo)致DC功能抑制以及DC誘導(dǎo)Tregs擴增，減弱了以DC為基礎(chǔ)的免疫治療作用。

因此，如何抑制Tregs活化、增殖，提高免疫細胞的抗腫瘤免疫，是目前克服骨髓瘤耐藥及復(fù)發(fā)的重要手段之一[21]。目前用于清除或抑制Tregs作用的途徑主要有：①用特異性抗體或Ontak(一種IL-2與毒素的融合蛋白)清除CD25+Tregs；②FOXP3疫苗,小鼠模型顯示，該疫苗能活化FOXP3特異性的細胞毒性T細胞，從而清除Treg細胞，增強抗腫瘤作用[22]；③研究證實,CpG寡脫氧核苷酸(CpG oligonucleotide)能與人Tregs上的Toll樣受體8結(jié)合，通過Toll樣受體8-髓樣分化因子88-白細胞介素1受體相關(guān)激酶4信號通路來逆轉(zhuǎn)Treg的抑制作用[23]。但值得注意的是，這些方法大多為非特異性的，可將識別腫瘤抗原或自身抗原的CD4+CD25+Tregs全部抑制或去除，這也可能使機體罹患自身免疫性疾病。目前應(yīng)用于MM治療的藥物(如環(huán)磷酰胺、氟達拉濱、雷利度胺等)均被證實具有清除MM患者Tregs的作用[24-25]。在對硼替佐米治療移植物抗宿主疾病研究中證實,其可通過抑制核因子κB通路抑制T細胞增殖、活化，對人體外周血Tregs有抑制、清除作用[26]。最近李瀅等[27]研究發(fā)現(xiàn),接受硼替佐米化療后,MM患者的Tregs水平下降更顯著，提示硼替佐米對MM患者的Tregs具有抑制作用，其通過解除機體免疫抑制的微環(huán)境來增強細胞免疫的抗腫瘤能力、重建細胞免疫間的平衡穩(wěn)態(tài)而達到良好地清除腫瘤的功能；而對于原發(fā)耐藥患者外周血Tregs的清除作用較少，化療療效不佳，提示抑制Tregs的增殖與功能仍是改善治療的關(guān)鍵因素之一。

3 結(jié) 語

MM至今仍難以治愈，嚴重危害人類健康，近年來隨著對其免疫缺陷及免疫治療策略的研究，免疫治療呈現(xiàn)出有希望的前景。CD4+CD25+Tregs是具有免疫負調(diào)節(jié)作用的重要T細胞亞群，目前在MM中的作用越來越受到關(guān)注。雖然MM患者體內(nèi)Tregs升高的原因及其發(fā)生免疫作用的機制還不十分清楚，但研究表明Tregs與MM病程進展、預(yù)后及免疫治療存在密切聯(lián)系，為MM治療提供了新的方向。

[1] Fontenot JD,Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance:regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005,6(4):331-337.

[2] Allan SE,Passerini L,Bacchetta R,etal.The role of 2-FOXP3 isoforms in the generation of human CD4+Tregs[J].J Clin Invest,2005,115(11):3276-3284.

[3] Hartigan-O′Connor DJ,Poon C,Sinclair E,etal.Human CD4+regulatory T cells express lower levels of the IL-7 receptor alpha chain(CD127),allowing consistent identification and sorting of live cells[J].J Immunol Methods,2007,319(1/2):41-52.

[4] Ralainirina N,Poli A,Michel T,etal.Control of natural killer(NK) cell functions by CD4+CD25+regulatory T cells[J].J Leukoc Biol,2007,81(1):144-153.

[5] Takahashi T,Kuniyasu Y,Toda M,etal.Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+naturally anergic and suppressive T cells:induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state[J].Int Immunol,1998,10(12):1969-1980.

[6] Dieckmann D,Bruett CH,Ploettner H,etal.Human CD4+CD25+regulatory,contact-dependent T cells induce interleukin 10-producing,contact-independent type 1-like regulatory T cells[J].J Exp Med,2002,196(2):247-253.

[7] Takahashi T,Tagami T,Yamazaki S,etal.Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4[J].J Exp Med,2000,192(2):303-310.

[8] Mellor AL,Munn DH.IDO expression by dendritic cells：tolerance and tryptophan catabolism[J].Nat Rev Immunol,2004,4(10):762-774.

[9] Gondek DC,Lu LF,Quezada SA,etal.Cutting edge:contact-mediated suppression by CD4+CD25+regulatory cells involves a granzyme B-dependent,perforin-independent mechanism[J].J Immunol,2005,174(4):1783-1786.

[10] Smyth MJ,Teng MW,Swarm J,etal.CD4+CD25+T regulatory cells suppress NK cell-mediated immunotherapy of cancer[J].J Immunol,2006,176(3):1582-1587.

[11] Enarsson K,Johnsson E,Lindholm C,etal.Differential mechanisms for T lymphocyte recruitment in normal and neoplastic human gastric mucosa[J].Clin Immunol,2006,118(1):24-34.

[12] Brimnes MK,Vangsted AJ,Knudsen LM,etal.Increased level of both CD4+FOXP3+regulatory T cells and CD14+HLA-DR-/lowmyeloid-derived suppressor cells and decreased level of dendritic cells in patients with multiple myeloma[J].Scand J Immunol,2010,72(6):540-547.

[13] Beyer M,Kochanek M,Giese T,etal.In vivo peripheral expansion of naive CD4+CD25highFoxP3+regulatory T cells in patients with multiple myeloma[J].Blood,2006,107(10):3940-3949.

[14] 韓文敏，邱國強，謝曉寶，等.CD4+CD25+/highCD127lowTregs及TGF-β在多發(fā)性骨髓瘤患者外周血的表達分析[J].細胞與分子免疫學雜志,2008,24(10):996-998.

[15] Prabhala RH,Neri P,Bae JE,etal.Dysfunctional T regulatory cells in multiple myeloma[J].Blood,2006,107(1):301-304.

[16] Strauss L,Bergmann C,Szczepanski M,etal.A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+T cells secreting interleukin-10 and transforming growth factor-β1mediates suppression in the tumor microenvironment[J].Clin Cancer Res,2007,13(15 Pt 1):4345-4354.

[17] Hansson L,Abdalla AO,Moshfegh A,etal.Long-term idiotype vaccination combinedwith interleukin-12(IL-12),or IL-12 and granulocyte macrophage colony-stimulating factor,in early-stage multiple myeloma patients[J].Clin Cancer Res,2007,13(5):1503-1510.

[18] Tarbell KV,Yamazaki S,Steinman RM.The interactions of dendritic cells with antigen-specific regulatory T cells that suppress autoimmunity[J].Semin Immunol,2006,18(2):93-102.

[19] 熊紅,吳秋業(yè)，廖洪利,等.糖基化修飾的DC疫苗特異性抗骨髓瘤活性的體外研究[J].中國免疫學雜志,2007,23(7):629-633.

[20] 丁巖松,陳文明.樹突狀細胞介導(dǎo)的T細胞抗多發(fā)性骨髓瘤細胞活性的研究[J].中華內(nèi)科雜志,2007,46(4):312-314.

[21] Joshua DE,Brown RD,Ho PJ,etal.Regulatory T cells and multiple myeloma[J].Clin Lymphoma Myeloma,2008,8(5):283-286.

[22] Nair S,Boczkowski D,Fassnaeht M,etal.Vaccination against the forkhead family transcription factor Foxp3 enhances tumor immunity[J].Cancer Res,2007,67(1):371-380.

[23] Peng G,Guo Z,Kiniwa Y,etal.Toll-like receptor 8-mediated reversal of CD4+regulatory T cell function[J].Science,2005,309(5739):1380-1384.

[24] Sharabi A,Laronne-Bar-On A,Meshorer A,etal.Chemoimmunotherapy reduces the progression of multiple myeloma in a mouse model[J].Cancer Prev Res(Phila),2010,3(10):1265-1276.

[25] Galustian C,Meyer B,Labarthe MC,etal.The anti-cancer agents lenalidomide and pomalidomide inhibit the proliferationand function of T regulatory cells[J].Cancer Immunol Immunother,2009,58(7):1033-1045.

[26] Blanco B,Péerez-Simóon JA,Sáanchez-Abarca LI,etal.Treatment with bortezomib of human CD4+T cells preserves natural regulatory T cells and allows the emergence of a distinct suppressor T-cell population[J].Haematologica,2009,94(7):975-983.

[27] 李瀅,李娟,黃蓓暉,等.硼替佐米對多發(fā)性骨髓瘤患者Treg細胞的影響及與腫瘤負荷、化療療效的關(guān)系[J].中國病理生理雜志,2012,28(6):985-990.