周志剛 秦 晶 姜 浩 蘇 琦

侵襲和轉移是惡性腫瘤的基本特征，是導致癌癥患者死亡的最重要原因之一。目前大量研究證實，LIM激酶(LIM kinase，LIMK)在多種人類腫瘤尤其高侵襲性的腫瘤中高表達。LIMK通過磷酸化和失活肌動蛋白解聚因子cofilin調節(jié)actin聚合，參與調節(jié)腫瘤血管的生成、腫瘤細胞遷移和增殖、細胞周期進展等多種腫瘤細胞生物學行為，促進腫瘤侵襲和轉移。因此，LIMK可能是一個很有潛力的遏制腫瘤侵襲轉移的治療靶點。

一、LIMK的結構及生物學功能

LIMK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，LIMK家族有兩個成員，即LIMK1和LIMK2。LIMK1基因位于7q11．23，含39499個堿基，包括16個外顯子;LIMK2基因位于22q12．2，含68617個堿基，包括19個潛在外顯子。兩者在結構上都具有兩個N-末端的LIM結構域、C-末端的激酶結構域與兩者之間的一個PDZ結構域。LIM激酶具有50%的整體序列同源性，而激酶結構域的序列同源性高達70%，其中LIM結構域由LIM1和LIM2一對鋅指結構域組成，富含半胱氨酸/組氨酸序列，是多種蛋白與蛋白之間相互作用的結構域，在調節(jié)激酶活性中起重要作用。PDZ結構域包括兩個富含亮氨酸的核輸出信號，可影響LIMK的核漿穿梭，使LIMK1優(yōu)先定位在細胞質中，而缺失PDZ結構域的LIMK1突變體則主要定位在細胞核中。C-末端激酶部分包含一個由一段堿性氨基酸殘基所構成的核定位序列［1］。

LIMK1和LIMK2均可磷酸化ADF/cofilin的第3位絲氨酸(Ser3)，使其不能切割F-actin形成G-actin而失活，從而調節(jié)肌動蛋白聚合，LIMK整合了多種調節(jié)肌動蛋白聚合的上游通路信號，對血管生成、細胞遷移、增殖、細胞周期、形態(tài)發(fā)生及癌變等多種細胞生物學功能具有重要影響。雖然LIMK1和LIMK2結構明顯相似，但兩者亞細胞定位不同，LIMK1主要定位于黏著斑，而LIMK2主要集中在細胞質中的斑點，這表明它們可能具有不同的細胞功能，LIMK1主要參與癌細胞中微管的拆卸及侵襲轉移，LIMK2則在促進細胞周期進展中起重要作用［2，3］。

二、LIMK的調節(jié)機制

1．LIMK活性的正調節(jié):LIMK的活性受到GTPase Rho蛋白調控。GTPase Rho蛋白家族成員包括Rho，Rac和 Cdc42，分別通過其下游效應激酶ROCK1/2、PAK1/2/4 和 MRCK α，使 LIMK 磷酸化而激活。Rho/ROCK1-2通過磷酸化LIMK1第508位蘇氨酸(Thr-508)和LIMK2第505位蘇氨酸(Thr-505)分別激活LIMK1和LIMK2［1］。遷移的腫瘤細胞前緣突出需要對板狀偽足中的F-actin網絡的精密調節(jié)，而Rac1/Pak1/LIMK1信號途徑可調控層狀偽足內的 ADF/cofilins活性，ADF/cofilins活性增加可加速F-actin倒轉和逆行流動，使層狀偽足變寬，促進遷移侵襲［4］。PAK2可誘導 LIMK和 cofilin磷酸化，沉默PAK2基因則使LIMK磷酸化明顯降低。肝細胞生長因子(HGF)可通過PAK4磷酸化LIMK1導致cofilin失活，促進前列腺癌細胞遷移侵襲［5］。PKA可通過磷酸化 Ser-323和Ser-596激活LIMK1［6］。腫瘤抑制蛋白Plexin C1通過上調LIMK2誘導cofilin磷酸化和失活，抑制黑色素瘤進展［7］。

2．LIMK活性的負調節(jié):抑制PAK調控細胞遷移的蛋白Nischarin的N-末端結構域與LIMK1的PDZ和激酶結構域的相互作用，可導致LIMK1的Thr-508磷酸化減少及其活性降低［8］。泛素連接酶Rnf6可結合并催化LIMK1多聚泛素化，導致其被蛋白酶體降解加快，半衰期從20h減少至4h［9］。研究發(fā)現，腦特異性miR-134可與LIMK1 mRNA的3'UTR結合而阻止mRNA的翻譯過程，下調LIMK1蛋白表達［10］。還有報道LATS1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ及Par-3也參與了LIMK的負性調節(jié)。

三、LIMK與腫瘤侵襲轉移

腫瘤侵襲和轉移是涉及到腫瘤細胞與宿主細胞和細胞間質之間的一個多步驟、多基因、多因素參與的極其復雜的過程，包括腫瘤血管生成、腫瘤遷移和增殖能力增強、細胞周期進展等多種腫瘤細胞生物學行為的改變。LIMK通過多種作用機制調節(jié)其下游蛋白在促進腫瘤侵襲和轉移的過程中扮演著重要角色。

1．LIMK與腫瘤血管生成:新生血管形成是腫瘤進展、侵襲和轉移多步驟過程中的一個重要環(huán)節(jié)，是一個涉及腫瘤發(fā)生、增殖及生長的多條通路的復雜動態(tài)的過程。腫瘤新生血管一般不夠成熟，管壁薄弱，基膜不完整，細胞間常有裂隙，因此通透性高，是腫瘤細胞血行轉移的最主要途徑。研究證實，血管生成在前列腺癌的進展過程中具有重要作用［11］。LIMK1在人乳腺癌組織中高表達，并且通過上調uPA表達，誘導裸鼠移植瘤血管的生成，高表達LIMK1的人乳腺癌細胞形成的移植瘤中血管數目是對照組移植瘤的3～4倍，在肺部和肝臟出現多個微小轉移灶的比率為38%，而對照組中未出現遠處轉移［12］。沉默LIMK1或LIMK2基因均能減少胰腺癌細胞誘導的腫瘤新生血管形成，雙重敲除LIMK1和LIMK2則可完全阻遏其侵襲及微小轉移灶的形成，證明LIMK1和LIMK在胰腺癌的進展與轉移起著重要作用［3］。VEGF可通過激活p38/MPKAP kinase-2/LIMK1通路觸發(fā)annexin 1的磷酸化，有助于內皮細胞的遷移和血管形成，而敲除LIMK1可遏制VEGF誘導內皮細胞遷移的能力［13］。LIMK可能通過多種分子機制參與腫瘤血管的生成，從而促進腫瘤細胞侵襲轉移。

2．LIMK與細胞遷移:腫瘤細胞的遷移能力與其侵襲轉移密切相關。研究顯示，LIMK1高表達可促進對長春新堿耐藥的骨肉瘤細胞的侵襲和轉移，而沉默LIMK1后骨肉瘤細胞遷移能力下降［14］。LIMK1可增強細胞的遷移而促進腫瘤細胞的轉移，敲除LIMK1可抑制鼠腹腔積液肝癌細胞的遷移侵襲能力［15］。抑制LIMK可通過減少細胞遷移而有效阻遏TGF-β所誘導的遷移與侵襲［16］。Nischarin可通過負調控LIMK/cofilin通路抑制LIMK活性與磷酸化cofilin而抑制的乳腺癌遷移侵襲［8］。Nischarin與絲氨酸-蘇氨酸激酶LKB1可共同調節(jié)PAK-LIMK-cofilin和cyclin D1/CDK4通路，Nischarin和 LKB1缺失導致PAK1和LIMK1磷酸化水平升高，促進侵襲性乳腺癌細胞的遷移與速度和腫瘤生長與肺轉移［17］。PKA可以直接磷酸化LIMK1，在細胞遷移過程中起重要作用［7］。PAK4相互作用蛋白 DGCR6L通過 PAK4/LIMK1通路可促進人胃癌細胞的遷移，沉默DGCR6L可明顯抑制遷移［18］。Fascin-1在很多惡性腫瘤中高表達，其通過與LIMK1/2形成復合物調節(jié)絲狀偽足的穩(wěn)定性而促進腫瘤細胞遷移［19］。PKD1可介導PAK4磷酸化，形成PAK4/LIMK/PKD1復合物調節(jié)cofilin活性，導致細胞遷移［20］。LIMK1的表達與結腸癌SW480細胞的遷移侵襲能力呈正相關，二烯丙基二硫可通過下調Rac1-ROCK1/PAK1-LIMK1-ADF/cofilin通路抑制SW480細胞的遷移與侵襲［21］。抑制PKCζ能降低膠質母細胞瘤的遷移侵襲能力，其機制與損害LIMK和cofilin磷酸化有關［22］。LIMK1在乳腺癌細胞質和胞核中均有表達，并可促進MDA-MB-231細胞侵襲能力增加與裸鼠移植瘤腫瘤生長［23］。p57kip2可增強LIMK1的活性磷酸化失活cofilin，而且能促進腫瘤細胞中肌動蛋白應力纖維的形成，導致肌動蛋白動態(tài)比減少，從而影響其在細胞中的周轉率，抑制腫瘤細胞遷移［24］。也有研究發(fā)現，敲除p57kip2可因LIMK1/2磷酸化水平降低而促進鼻咽癌細胞的遷移與侵襲。

3．LIMK與增殖:在惡性腫瘤細胞中促進細胞增殖的信號通路通常是激活的，LIMK1作為一種關鍵的細胞骨架調節(jié)劑，常參與對細胞增殖的調節(jié)。LIMK1可促進人乳腺癌細胞增殖率增加50% ～83%，并通過增加uPA在腫瘤中的表達促進裸鼠移植瘤的生長，而且腫瘤壞死區(qū)域減少［12］。敲除 LIMK1和LIMK2可導致胰腺癌細胞增殖下降［3］。然而，也有研究發(fā)現在人的結直腸癌細胞系和腫瘤中LIMK2的表達是降低的，而且LIMK2表達和活性是隨著疾病進展而逐步降低，同時證實LIMK2可抑制胃腸干細胞的增殖，LIMK2缺失的小鼠癌癥模型中結腸腫瘤的體積增加以及出現更嚴重的不典型增生和過度增生表型，LIMK2表達和底物磷酸化的減少均與患者的生存期短有關［25］。因此LIMK對細胞增殖的影響可能是多方面的，目前仍需進一步研究。

4．LIMK與細胞周期:LIMK也參與細胞周期進展，而且LIMK1和LIMK2在細胞分裂的過程中具有不同的作用。研究證實，LIMK1在前列腺腫瘤和前列腺癌細胞中高表達，在轉移性前列腺癌細胞中磷酸化cofilin濃度更高，減少LIMK1可使細胞阻滯于G2/M期而抑制細胞增殖。在G1期LIMK1有助于保持細胞外信號調節(jié)激酶的活性，在有絲分裂的前中期和中期階段LIMK1的活性和cofilin的磷酸化水平增加，在后期、末期和胞質分裂期恢復到基礎水平，在有絲分裂過程中抑制LIMK1的活性，可延遲有絲分裂進程(中期到后期)。在3T3小鼠成纖維細胞中ROCK可活化LIMK2導致細胞周期蛋白A水平增加而促進G1/S期細胞周期進展。在MDA-MB-435腫瘤細胞中過度表達LIMK1也能使細胞周期明顯進展［13］。

LIMK主要通過磷酸化和失活cofilin調節(jié)肌動蛋白聚合，促進腫瘤侵襲和轉移。然而，最新的研究卻發(fā)現LIMK1活性增加可通過影響肌動蛋白在細胞中的周轉率而抑制腫瘤細胞遷移［24］。LIMK2能抑制胃腸干細胞的增殖［26］。也有報道認為LIMK2b是一種潛在的腫瘤抑制基因，LIMK2b在食管癌和甲狀腺癌中下調，LIMK2b高表達使腫瘤細胞G2/M阻滯延長并抑制腫瘤細胞遷移。亦有研究證實LIMK2參與了刺激膜雄激素受體誘導前列腺癌細胞的凋亡過程。另外，LIMK還可通過形成促凋亡DAPK/LIMK/cofilin多蛋白復合物而參與TNF誘導細胞凋亡。因此，有關LIMK對腫瘤細胞生物學功能的調節(jié)作用及其機制，仍需更深入細致的研究。而且，當前對于LIMK的相關研究大多數是建立在體外實驗或動物實驗基礎上，臨床研究還不多，希望以后多開展臨床方面研究，同時為開發(fā)針對LIMK的高效、特異、低毒的抑制劑找到突破點。

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