李 旭(綜述)，劉連新(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外六科，哈爾濱 150001)

腫瘤高甲基化基因1(hypermethylated in cancer 1，HIC1)定位于染色體部17p13.3位點、腫瘤抑制基因p53遠(yuǎn)端。這個基因可以編碼一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且廣泛存在于正常組織中，但是在不同的腫瘤組織中，由于其高甲基化而低表達(dá)。染色體區(qū)域的高甲基化導(dǎo)致HIC1的繼發(fā)性失活，繼而在腫瘤形成時期促進(jìn)信號通路或相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及腫瘤細(xì)胞的活力。體外研究證實，HIC1的功能主要是特異的轉(zhuǎn)錄抑制因子，可被組蛋白脫乙?；敢蕾嚮蚍且蕾囕o阻遏物復(fù)合物失活[1]。此外，HIC1在腫瘤發(fā)展中的作用已經(jīng)被HIC1缺陷小鼠模型和p53、Ptch1異性結(jié)合體模型所證實[2]。腫瘤微環(huán)境中提取的潛在因子可能通過后天修飾來調(diào)整HIC1的表達(dá)，從而引導(dǎo)腫瘤的生成。

1 HIC1基因結(jié)構(gòu)和功能區(qū)

1.1HIC1基因結(jié)構(gòu) 目前，研究發(fā)現(xiàn)人和鼠HIC1基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)十分相似[3]。人HIC1轉(zhuǎn)錄可以開始于P0、P1和P2三個啟動區(qū)，可以引發(fā)三個交替的第一外顯子1a、1b和1c，隨后的是第二編碼外顯子，包括3′末翻譯區(qū)。外顯子1a和1c與主要的GC富集啟動區(qū)P1和P2分別相關(guān)并且未編碼，而外顯子1b與 P0 TATA box啟動區(qū)相關(guān)且部分編碼。外顯子1b包含一個ATG′密碼子，這個密碼子定位于外顯子2的ATG啟動密碼子框架中。兩個新的轉(zhuǎn)錄因子1d和1e來自于外顯子1c中的附加銜接產(chǎn)物，而且均由啟動區(qū)P2轉(zhuǎn)錄而來。非拼接的轉(zhuǎn)錄因子1f是外顯子1b中的ATG′轉(zhuǎn)錄而來，但是終止于非拼接內(nèi)含子序列的TGA終止密碼子[3]。簡而言之，6個HIC1轉(zhuǎn)錄物(1a～f)是產(chǎn)生于三個不同啟動區(qū)。

1.2HIC1蛋白結(jié)構(gòu) HIC1基因剪接變體可以導(dǎo)致各自的蛋白異形體。主要的1a型轉(zhuǎn)錄物經(jīng)由外顯子2的開放框架直接合成一個714氨基酸的蛋白編碼。1b型轉(zhuǎn)錄物能夠編碼一個包含19個附加N端氨基酸的特異蛋白(12個來自外顯子1b和7個來自外顯子2的5′序列)。非拼接轉(zhuǎn)錄物1f通過內(nèi)含子的未成熟終止密碼子可以合成一個22個氨基酸的多肽。

HIC1蛋白的N端鋅指蛋白含有120個氨基酸，是二聚體化功能域，通過構(gòu)象變化直接或間接作用與蛋白質(zhì)相互作用。這個區(qū)域還包含一個自發(fā)轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)。HIC1的效應(yīng)元件定位于它的靶基因的啟動區(qū)。最近，Pinte等[3]證實了序列5′-C/GNGC/GGGGCAC/A CC-3′是HIC1最佳結(jié)合位點。有報道稱，B細(xì)胞淋巴瘤6的BTB/POZ區(qū)通過特殊方式直接互補核輔阻遏物或視黃酸和甲狀腺激素受體沉默調(diào)節(jié)子復(fù)合物，但是它對制滴菌素A不敏感[4]。HIC1 BTB/POZ區(qū)能夠直接結(jié)合class Ⅲ組蛋白去乙?；傅慕Y(jié)合型信息沉默調(diào)節(jié)因子1(silent mating type information regulation homolog-1，SIRT1)啟動區(qū)，形成一個轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物來抑制SIRT1的轉(zhuǎn)錄。

C端包含一組四個保守的C2H2鋅指鍵。這個區(qū)域能夠結(jié)合特定的DNA序列HiRE和上游遠(yuǎn)端的鋅指結(jié)構(gòu)。被典型的7～8個氨基酸保守H/C環(huán)分離后的鋅指鍵可能與DNA特異序列綁定有關(guān)。

中央?yún)^(qū)是HIC1的第二個自發(fā)轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)，從人到斑馬魚共包含4個完全保守的縮氨酸基序[5]。其中的一個序列GLDLSKK在蛋白中可與聯(lián)合抑制物CtBP相互作用。這個抑制區(qū)，不管是CtBP依賴還是非依賴抑制型，均對制滴菌素A敏感。

2 HIC1后天修飾調(diào)節(jié)腫瘤生成

2.1HIC1啟動子高甲基化 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展被基因和后天因素調(diào)節(jié)。后天機制可以改變基因表達(dá)，但不能改變DNA原始序列，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼微RNA(microRNA，miRNA)等改變。后天過程的破壞可導(dǎo)致基因功能的改變和惡性的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。實際上，普遍認(rèn)為異常的后天修飾是腫瘤發(fā)展的主要因素[6]。

普遍的觀點是：HIC1是腫瘤抑制因子，在許多原發(fā)腫瘤和血液腫瘤中HIC1基因表達(dá)沉默，如前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌和肝癌、食管癌、小兒髓母細(xì)胞瘤[7-8]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤[9]。應(yīng)用HIC1探針、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)和亞硫酸氫鹽測序后發(fā)現(xiàn)，在多數(shù)人類腫瘤和白血病中，HIC1多數(shù)高甲基化。HIC1啟動區(qū)的高甲基化導(dǎo)致HIC1基因表達(dá)沉默，在腫瘤發(fā)展過程中HIC1表達(dá)水平全部降低。 然而，在正常小兒腦組織、成人腦組織[10]和前列腺上皮細(xì)胞也可發(fā)現(xiàn)HIC1啟動子的高甲基化。而且，在急性白血病中HIC1甲基化極少(10%)，而在慢性髓性白血病中則為50%[11-12]。但是，在所有的急性淋巴細(xì)胞白血病和慢性髓性白血病的原始細(xì)胞危象中均可見HIC1甲基化。因此，HIC1高甲基化被認(rèn)為是造血組織腫瘤的晚期表象，且可能存在其他抑制HIC1表達(dá)的機制。

2.2HIC1轉(zhuǎn)錄靶點 HIC1的一個重要的轉(zhuǎn)錄靶點是SIRT1脫乙酰酶。SIRT1能夠通過脫乙酰作用激活p53從而減弱其激活下游靶點，包括調(diào)節(jié)凋亡和增殖的作用。有報道稱,在正常生理條件下HIC1抑制SIRT1轉(zhuǎn)錄從而抑制p53的脫乙酰化，但在腫瘤細(xì)胞中HIC1由于后天修飾失活，SIRT1表達(dá)水平升高[13]。這就導(dǎo)致脫乙酰化和p53活性降低，細(xì)胞因此停止凋亡。此外，PRE(p53效應(yīng)元件)被證實存在于HIC1啟動子區(qū)域，說明HIC1是p53直接靶基因[14]，而且p53可以不依賴其甲基化水平直接激活HIC1轉(zhuǎn)錄。因此，HIC1/SIRT1/p53調(diào)節(jié)環(huán)是一個基本通路，HIC1通過這個通路和p53協(xié)同，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[15]。

Briones等[16]發(fā)現(xiàn)HIC1的核結(jié)合序列是GGCA，而且這個序列存在于成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白(fibroblast growth factor-binding protein1,FGF-BP1)啟動子區(qū)域，定位于-785～-782 bp(GGCA)。Briones等[16]同時指出，轉(zhuǎn)化生長因子β調(diào)節(jié)的FGF-BP1啟動區(qū)HIC1核結(jié)合位點的突變可以顯著影響其轉(zhuǎn)錄抑制作用。轉(zhuǎn)化生長因子β是生長因子家族中的經(jīng)典成員，在正常的血管發(fā)生及多種人類疾病中起重要作用，表明HIC1通過轉(zhuǎn)化生長因子β的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制FGF-BP1，從而影響腫瘤的血管生成。也就是失活腫瘤細(xì)胞中的HIC1可以增加FGF-BP1的表達(dá)，從而引起腫瘤血管生成和增殖的增加。

Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)，HIC1可以直接調(diào)節(jié)ephrin-A1基因的一個轉(zhuǎn)錄抑制子，結(jié)果顯示小鼠胚胎缺失HIC1等位基因和錯誤表達(dá)ephrin-A1都可引起發(fā)育異常。過表達(dá)ephrin-A1是HIC1雜合子引發(fā)腫瘤的一個重要特點。恢復(fù)乳腺癌中HIC1的功能可以導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤生長減慢，而過表達(dá)ephrin-A1可以拮抗這種作用。由此可以得出結(jié)論，腫瘤細(xì)胞中沉默的HIC1可以導(dǎo)致ephrin-A1的表達(dá)上調(diào)，從而引起體內(nèi)腫留的生長。在高度惡性MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系中HIC1的異位表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過RNA調(diào)節(jié)失活正常乳腺上皮細(xì)胞中的HIC1，可以引起ephrin-A2的表達(dá)上調(diào)和細(xì)胞遷移的增加。因此，通過HIC1沉默引起的Eph通路失調(diào)節(jié)可能是上皮瘤發(fā)病的一個重要機制[18]。

Briggs等[19]發(fā)現(xiàn)，HIC1是細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)因子E2F1的一個新的轉(zhuǎn)錄靶點。在包含HIC1 P0啟動子的TATA-box中，E2F1通過兩個E2F DNA結(jié)合位點影響HIC1。1在體內(nèi)，E2F1和HIC1啟動子區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)源性HIC1 mRNA表達(dá)。而且，即使HIC1 P0啟動子高甲基化，HIC1表達(dá)仍受E2F1調(diào)節(jié)。這一發(fā)現(xiàn)表明在E2F1和HIC1之間存在一個調(diào)節(jié)環(huán)。有可能內(nèi)源性E2F1蛋白直接結(jié)合HIC1 P0啟動子，從而激活HIC1表達(dá)；反之，HIC1結(jié)合包含HIC1結(jié)合序列位點的E2F1啟動子基因，從而抑制E2F1轉(zhuǎn)錄減少細(xì)胞生長。

有報道稱，HIC1可以直接作用于T細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子4(transcription of cell factor 4，TCF4)[20]。TCF4和β聯(lián)蛋白相互作用激活Wnt信號，在正常發(fā)育中這個激活很重要，而它的異常調(diào)節(jié)在腫瘤發(fā)生中起重要作用。這可能抑制腫瘤的形成，因為TCF4和β聯(lián)蛋白可以阻止激活腫瘤發(fā)育過程中相關(guān)的TCF效應(yīng)基因，包括c-myc或細(xì)胞中期蛋白D1。

通過啟動子熒光素酶激活、ChIP和序列ChIP試驗，β-2腎上腺素能受體(adrenergic receptors β-2,ADRB2)被證實是HIC1的直接靶基因。ADRB2編碼一個可以被腎上腺素/去甲腎上腺素激活的G蛋白偶聯(lián)受體[21]。在正常肺胚胎成纖維細(xì)胞WI(wistsar institute)-38中，通過反轉(zhuǎn)錄病毒感染過表達(dá)HIC1可以引起ADRB2 mRNA的顯著減少和蛋白水平的輕微下降。相反，通過小干擾RNA抑制WI-38細(xì)胞中HIC1表達(dá)可以引起ADRB2轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的升高。在惡性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中，ADRB2高表達(dá)，HIC1過表達(dá)可以明顯抑制ADRB2表達(dá)和阻止其促進(jìn)遷移及侵襲的作用，表明腫瘤形成時通過HIC1的沉默上調(diào)ADRB2的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

2.3腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物 很多研究注重于后天標(biāo)記在干細(xì)胞鑒定中的作用。在胚胎干細(xì)胞中，一些發(fā)育轉(zhuǎn)錄因子的啟動子處于“二價狀態(tài)”，激活(H3K9Ac和H3K4me)和抑制(H3K27me)。因此，這些啟動子處于一種轉(zhuǎn)錄準(zhǔn)備的“平衡”狀態(tài)，根據(jù)發(fā)育的需要，可以被激活為組織特異性基因或抑制其他發(fā)育通路的基因。實際上，在分化的細(xì)胞中，許多非轉(zhuǎn)錄基因的啟動子沒有激活標(biāo)志，并且被多梳抑制復(fù)合物2沉積的H3K27三甲基化標(biāo)志物所濃縮。在胚胎干細(xì)胞中的研究證實，一些腫瘤抑制基因在結(jié)腸癌、乳腺癌和卵巢癌中均有三甲基化的H3K27和其他多梳抑制復(fù)合物2預(yù)標(biāo)記[22-23]。

HIC1被定義為“干細(xì)胞基因”，這是因為其可以被同源物種抑制因子12、雌激素樣物質(zhì)和組蛋白H3賴氨酸4三甲基化中的至少兩個所標(biāo)記，這三個基因存在于人類結(jié)直腸癌、卵巢癌中的胚胎干細(xì)胞細(xì)胞和CD34陽性造血祖細(xì)胞中[23]。但是在乳腺癌中除外，這可能是由于正常乳腺上皮細(xì)胞的半甲基化。另外，HIC1在人類胚胎干細(xì)胞細(xì)胞中不甲基化，而在胚胎癌性細(xì)胞系Tera-1和Tera-2中分別部分和全部甲基化[24]。

3 腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)HIC1表達(dá)

3.1特異基因的DNA甲基化構(gòu)成腫瘤微環(huán)境 研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化遺傳于體細(xì)胞分裂，并且CpG島啟動子的甲基化可以沉默其下游基因[24]。改變腫瘤細(xì)胞的甲基化可以導(dǎo)致腫瘤抑制基因和其他基因的失活。很多研究揭示，異常甲基化甚至存在于非癌性組織，但是其等級和癌變率相關(guān)，如量化甲基化可以發(fā)現(xiàn)異常甲基化比突變更常見[25]，并且已經(jīng)證實甲基化改變存在于上皮-間質(zhì)遷移中[26-27]。甲基化改變的頻繁說明它可能與間質(zhì)細(xì)胞的表型改變有關(guān)，即形成腫瘤微環(huán)境[28-29]。不光是上皮細(xì)胞癌變，在間質(zhì)細(xì)胞形成腫瘤微環(huán)境中，DNA甲基化也起到重要作用，說明特殊基因的DNA甲基化能夠誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞碎片。同時也說明，改變甲基化水平能夠參與形成腫瘤微環(huán)境。已經(jīng)有報道在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中存在特殊基因的沉默導(dǎo)致的組蛋白修飾改變[30]。腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)遷移產(chǎn)生的間質(zhì)細(xì)胞有可能參與形成腫瘤微環(huán)境[31]。

3.2腫瘤微環(huán)境可能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞HIC1的表達(dá) HIC1作為抑制基因在腫瘤中并未突變，但后天調(diào)節(jié)的功能缺失可能存在于腫瘤形成階段。Xia等[32]最近發(fā)現(xiàn)，前列腺素E2通過增強CpG島甲基化沉默這些腫瘤抑制物和DNA-修復(fù)基因，從而促進(jìn)腸道腫瘤的生長。Ng等[33]指出，miR-143在結(jié)直腸癌中調(diào)節(jié)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A。這個發(fā)現(xiàn)幫助人們推斷腫瘤微環(huán)境中的某些因子也能通過后天性修飾調(diào)節(jié)HIC1表達(dá)。實際上，不同的腫瘤環(huán)境影響組蛋白或DNA的后天性修飾，改變轉(zhuǎn)錄因子到DNA序列的通路，從而影響基因表達(dá)[33-34]。此外，腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞分泌的一些炎性因子和miRNA能夠增加腫瘤細(xì)胞的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶類和組蛋白脫乙酰基酶活性，因此沉默包括HIC1在內(nèi)的腫瘤抑制基因和重構(gòu)腫瘤細(xì)胞表型。目前，新的后天性治療抗腫瘤藥物主要是復(fù)活腫瘤抑制基因[35]。然而，鑒于它們的通用基因調(diào)節(jié)環(huán)，后天治療應(yīng)該同樣關(guān)注腫瘤微環(huán)境的作用。這可能提供更多的腫瘤治療方案。

4 小結(jié)與展望

HIC1通過結(jié)合SIRT1啟動子，可以中樞轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)一些控制細(xì)胞生長和死亡的關(guān)鍵基因。通過與PATCHED基因結(jié)合，HIC1能成為髓母細(xì)胞瘤Hedgehog通路抑制劑，并且能夠調(diào)節(jié)干細(xì)胞中Wnt通路。實際上，在許多腫瘤和白血病中，HIC1由于高甲基化而沉默或低表達(dá)，這可能成為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如地西他濱等)藥物新的治療靶點。然而，HIC1的一些問題還不明朗。首先，在靶基因DNA結(jié)合區(qū)HIC1蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)如何實現(xiàn)。其次，HIC1有大量潛在的生理學(xué)功能，但HIC1特定靶基因的數(shù)量卻很少。再次，腫瘤微環(huán)境如何調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中HIC1的表達(dá)還不清楚。最后，由于發(fā)現(xiàn)低HIC1水平有助于腫瘤生長，可能存在除了HIC1啟動子高甲基化外的其他抑制機制?？傊M(jìn)一步研究HIC1的功能和其作用靶點不光可以幫助人們明確它作為腫瘤抑制基因的功能和對腫瘤微環(huán)境的研究提供新的視點，還能夠?qū)υS多人類腫瘤提供新的治療方案。

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