馮 睡(綜述)，安廣宇，尹金淑(審校)

(1.北京大學(xué)第九臨床學(xué)院,北京 100038； 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院腫瘤科,北京 100020；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院耳鼻咽喉科,北京 100038)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，在再生醫(yī)學(xué)、藥物研究、疾病模型等領(lǐng)域有很大應(yīng)用前景，但是材料來源、免疫排斥、倫理等方面問題一直限制著其研究發(fā)展。2006年，Takahashi等[1]將Oct-4、Sox-2、Klf-4和c-myc四種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，使其重編程為具有類似ESC特征的誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。與以往通過體細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合及細(xì)胞抽提物孵育來獲取ESC樣細(xì)胞的技術(shù)不同，iPSC技術(shù)擺脫了材料來源限制，繞開了倫理困境，迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)就iPSC技術(shù)研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 iPSC技術(shù)

經(jīng)典的iPSC技術(shù)路線主要包括以下步驟：①選擇宿主細(xì)胞；②選擇外源重組因子；③重組因子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；④重編程產(chǎn)生iPSC；⑤iPSC的鑒定及分化[1]。

1.1宿主細(xì)胞來源 Yamanaka[2]將小鼠體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC開啟了該技術(shù)的先河，之后人、大鼠、猴、豬、綿羊,甚至一些瀕危動(dòng)物的iPSC系紛紛建立[3]。就人類而言，目前已從皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)成形細(xì)胞、羊水、神經(jīng)前體細(xì)胞、外周血細(xì)胞,甚至尿液中獲得iPSC[3-4]。不同組織來源細(xì)胞重編程效率及所需因子不同。不僅iPSC分化能力因人而異，在表觀遺傳穩(wěn)定性和癌基因的表達(dá)方面也存在男女有別現(xiàn)象[5]。使得iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床個(gè)體治療更具挑戰(zhàn)性。

1.2重組因子的選擇及導(dǎo)入方式 經(jīng)典的Yamanaka因子在癌細(xì)胞中存在超表達(dá)、整合型載體可導(dǎo)致插入突變，且誘導(dǎo)效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于尋求更安全、簡(jiǎn)單、有效的誘導(dǎo)策略。Anokye-Danso等[6]應(yīng)用微RNA調(diào)控技術(shù)，不使用轉(zhuǎn)錄因子高效誘導(dǎo)iPSC。Zhou等[7]和Kim等[8]分別利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽與轉(zhuǎn)錄因子蛋白的融合蛋白，直接誘導(dǎo)受體細(xì)胞為iPSC，但效率較低。一些學(xué)者利用腺病毒、質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，或利用Cre/LoxP系統(tǒng)、oriP/EBNAI系統(tǒng)及piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源基因整合后再特異性切除，從而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下現(xiàn)象[3]。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、維生素C、篩選激酶抑制劑、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的應(yīng)用可顯著提高iPSC的產(chǎn)生效率[3,9-10]。

1.3iPSC的誘導(dǎo)分化 Zhao等[11]利用iPSC通過四倍體囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，證明了iPSC的全能性。目前，人們已成功地將iPSC在體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、耳蝸毛細(xì)胞、色素細(xì)胞等類型細(xì)胞[3]。

1.4iPSC機(jī)制相關(guān)研究突破 研究人員長(zhǎng)期受困于體細(xì)胞重編程的具體機(jī)制。Polo等[12]繪制出體細(xì)胞重編程為iPSC的分子線路圖,證實(shí)誘導(dǎo)過程引起了兩次轉(zhuǎn)錄波,分別是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驅(qū)動(dòng)，并確定了重編程過程中路障基因?；趇PSC技術(shù)已證明細(xì)胞的分化過程并非不可逆轉(zhuǎn)，研究人員利用細(xì)胞直接重編程技術(shù)將已分化細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成特定譜系的細(xì)胞，利用間接譜系轉(zhuǎn)化技術(shù)部分去分化生成多潛能祖細(xì)胞，為干細(xì)胞研究開辟了新思路[13]。

2 臨床應(yīng)用前景

iPSC因其分化全能性、體外易擴(kuò)增、易于基因干擾或過表達(dá)等特性，在再生醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)評(píng)價(jià)、組織工程等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用前景。

2.1疾病特異iPSC 動(dòng)物疾病模型由于種屬差異，不能真實(shí)反映人類疾病，利用疾病特異的iPSC系建立的iPSC疾病模型則可彌補(bǔ)這一缺陷，還可在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)觀察疾病。當(dāng)前已建立包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、脊髓性肌萎縮、唐氏綜合征、脆性X綜合征)，血液系統(tǒng)疾病(范科尼貧血、鐮刀細(xì)胞型貧血、β地中海貧血、原發(fā)性骨髓纖維化)，代謝系統(tǒng)疾病 (1型糖尿病，Ⅲ型戈謝病，Shwachman-Bodian-Diamond綜合征、肌營(yíng)養(yǎng)不良、萊施-奈恩綜合征)及其他疾病(右心室心肌病)等特異的iPSC系[3,14]。

2.2藥物研發(fā)及篩選 大規(guī)模藥物篩選需要很多細(xì)胞，iPSC可以無限增殖，并且疾病特異iPSC本身就是篩選藥物的目標(biāo)。Takayama等[15]導(dǎo)入Foxa2及肝細(xì)胞核因子1α到人類ESC/iPSC產(chǎn)生具有代謝功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，對(duì)篩查藥物肝毒性具有重大意義。Lippmann等[16]將iPSC轉(zhuǎn)化為血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物高通量篩選或藥物神經(jīng)毒性檢測(cè)。Egawa等[17]利用肌萎縮側(cè)索硬化癥患者iPSC分化而來的神經(jīng)細(xì)胞來篩選并確認(rèn)藥物效果，發(fā)現(xiàn)漆樹酸具有改善神經(jīng)異常的作用。

2.3組織工程學(xué)應(yīng)用 用干細(xì)胞培養(yǎng)的人體組織是理想的器官再造來源。英國(guó)已經(jīng)報(bào)道利用3D打印技術(shù)為癌癥患者重塑面部，F(xiàn)aulkner-Jones等[18]將3D打印拓展到人ESC范圍，當(dāng)3D打印技術(shù)能夠兼容iPSC時(shí)，組織工程學(xué)將邁上一個(gè)新的臺(tái)階。

2.4臨床疾病治療

2.4.1神經(jīng)系統(tǒng)疾病 帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，目前治療手段只能改善癥狀。Kikuchi等[19]利用iPSC分化出能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞，然后移植到帕金森病猴子腦部，這些細(xì)胞存活半年以上，并持續(xù)釋放多巴胺，很大程度上減輕了患病猴子的癥狀。Jiang等[20]將帕金森病患者和健康志愿者皮膚細(xì)胞來源iPSC誘導(dǎo)為腦細(xì)胞并對(duì)比，觀察到parkin基因發(fā)生突變產(chǎn)生自由基破壞多巴胺神經(jīng)元是帕金森病發(fā)病機(jī)制之一。除帕金森病外，在阿爾茨海默病、脊髓側(cè)索硬化癥、脊髓肌肉萎縮癥及舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病研究中，iPSC也取得許多進(jìn)展[3]。

2.4.2血液系統(tǒng)疾病 Hanna等[21]將人類鐮刀型貧血癥小鼠皮膚成纖維細(xì)胞建立的iPSC，通過同源重組技術(shù)獲得正?；蛐蚷PSC，誘導(dǎo)為造血干細(xì)胞并移植后可治療動(dòng)物模型的鐮狀細(xì)胞性貧血。Xu等[22]用iPSC來源的內(nèi)皮前體細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞移植到血友病小鼠肝臟中，病鼠出血癥狀得到了改善。Raya等[23]獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPSC，其能夠分化成表型正常的髓系和紅系造血祖細(xì)胞。最近，日本學(xué)者利用iPSC培養(yǎng)出一種能產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成素的細(xì)胞，有望用于治療腎性貧血。

2.4.3心血管系統(tǒng)疾病 2008年，Schenke-Layland等[24]成功地將小鼠iPSC在體內(nèi)和體外分別誘導(dǎo)出了心肌細(xì)胞。之后，Nelson等[25]將iPSC分化得到的心肌細(xì)胞移植入具有完整免疫系統(tǒng)的成年小鼠梗死心臟內(nèi)，能夠觀察到功能性的新生心肌。Tohyama等[26]使用不含葡萄糖的低成本培養(yǎng)液獲得大量純度高達(dá)99%的心肌細(xì)胞，且?guī)缀醪淮嬖诎┗L(fēng)險(xiǎn)。而Zhang等[27]證實(shí)iPSC具有分化為心房、心室和竇房結(jié)細(xì)胞等的潛能。

2.4.4感官疾病 感音神經(jīng)性聾的主要原因是毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退變和死亡，而其治愈需要相關(guān)結(jié)構(gòu)的修復(fù)或再生。Nishimura等[28]將iPSC來源神經(jīng)祖細(xì)胞移植到小鼠耳內(nèi)，觀察到這些神經(jīng)細(xì)胞開始表達(dá)谷氨酸神經(jīng)元的標(biāo)志性因子，表明iPSC可用于螺旋神經(jīng)節(jié)損傷的再生修復(fù)。Oshima等[29]使用小鼠ESC及iPSC成功分化出了功能性內(nèi)耳毛細(xì)胞。Mizutari等[30]使用γ-分泌物抑制劑抑制Notch信號(hào)通路，刺激支持細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槊?xì)胞，首次證明成熟哺乳動(dòng)物的感音毛細(xì)胞也能再生。

感音毛細(xì)胞的損傷導(dǎo)致聽力損失，感光細(xì)胞的損失則導(dǎo)致視力損失。Meyer等[31]將iPSC分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，成功治愈1例回旋狀脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮癥患者。Singh等[32]將發(fā)育中的感光細(xì)胞移植到盲鼠眼睛中，能夠再次形成視網(wǎng)膜的整個(gè)光敏感層，恢復(fù)視覺。

2.4.5內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病 Tateishi等[33]將正常人iPSC培養(yǎng)成胰島素分泌型的胰島細(xì)胞，其不僅能分泌C肽和胰高血糖素，而且能通過感受葡萄糖的刺激來調(diào)節(jié)C肽的分泌。Maehr等[34]用1型糖尿病患者的成纖維細(xì)胞來源iPSC分化出了具有胰島素分泌功能的細(xì)胞。這些研究使糖尿病患者特異細(xì)胞治療成為可能。

2.4.6生殖系統(tǒng)疾病 Park等[35]將iPSC體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞，其與體內(nèi)分離的原始生殖細(xì)胞在基因表達(dá)上極相似。Hayashi等[36-37]將小鼠 ESC和iPSC在體外誘導(dǎo)成為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞并分化為功能正常的精子和卵子。如果能進(jìn)一步將人原始生殖細(xì)胞體外分化為精子和卵子，就有望治療不孕不育癥。

2.4.7運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病 杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良是一種X染色體隱性遺傳病，患者早期即出現(xiàn)肌肉無力或萎縮，嚴(yán)重威脅生命安全。Filareto等[38]將杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠皮膚細(xì)胞重編程為了iPSC，進(jìn)行遺傳修復(fù),再分化成骨骼肌干細(xì)胞進(jìn)行移植治療，能產(chǎn)生功能性肌肉，并檢查到新形成的肌纖維表達(dá)修復(fù)后的標(biāo)記,證明了iPSC技術(shù)結(jié)合遺傳修復(fù)技術(shù)治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良的可行性。Diekman等[39]利用iPSC在小鼠實(shí)驗(yàn)中培育出無再生能力的軟骨，有望成為人造軟骨組織的來源。

2.4.8腫瘤 Chen等[40]用小鼠iPSC培育出了癌癥干細(xì)胞，并確認(rèn)其發(fā)展成癌細(xì)胞的過程。Yang等[41]發(fā)現(xiàn)人類iPSC來源的神經(jīng)干細(xì)胞可以靶向腫瘤，或可用于聯(lián)合基因治療，抑制腫瘤生長(zhǎng)。Vizcardo等[42]從惡性黑色素瘤患者體內(nèi)提取出T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)出iPSC再分化成為T淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些T細(xì)胞能夠識(shí)別黑色素瘤特異性蛋白黑色素瘤抗原1，繼續(xù)攻擊癌細(xì)胞。此方法能夠大量培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞，有望在此基礎(chǔ)上開發(fā)出治療癌癥的新型免疫療法。

2.4.9其他人類疾病 CCR5(C-C chemokine receptor type 5)是人類免疫缺陷病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的重要輔助受體，缺乏CCR5使人類免疫缺陷病毒不能感染人體。Yao等[43]用鋅指核酸酶技術(shù)剔除患者iPSC的CCR5基因，并誘導(dǎo)成造血干細(xì)胞，為艾滋病的治療提供一條新的可能途徑。Arakaki等[44]將小鼠iPSC與小鼠齒源性上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化為成釉細(xì)胞，且含有作為牙釉質(zhì)成分的成釉蛋白，這對(duì)牙齒再生和修復(fù)研究至關(guān)重要。

3 展 望

iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床前必須確保其安全性。目前存在的主要問題：iPSC帶有自身表觀遺傳印記和端粒異常；與ESC相比存在少量基因異常表達(dá)；誘導(dǎo)本身及傳代過程都可導(dǎo)致變異[3]。而且自體iPSC移植回患者機(jī)體后會(huì)否引起免疫反應(yīng)一直存在著爭(zhēng)議。雖然存在各種疑惑和爭(zhēng)論，但iPSC技術(shù)潛力不可限量，隨著iPSC機(jī)制研究的進(jìn)展，許多問題將迎刃而解，種種困難并不能減退人們對(duì)iPSC技術(shù)的研究熱情，iPSC技術(shù)必將勢(shì)不可擋地推動(dòng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。

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