文 軍，李 東(綜述),段建民※(審校)

(1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院口腔科，廣州510010； 2.東華醫(yī)院口腔科，廣東 東莞 523220)

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一種未分化細胞，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有自我復制以及在一定條件下向骨、軟骨、脂肪和肌肉等組織細胞分化的能力。因此，以MSCs為基礎的細胞療法得到廣泛的研究，并且在臨床上開展應用。在臨床應用的準備階段，MSCs需要在體外進行大量擴增。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)能為細胞的增殖、遷移和分化等生物學行為提供營養(yǎng)、生長因子和激素等生物活性物質，是應用于細胞培養(yǎng)的最常見物質。然而，F(xiàn)BS含有的大量異種蛋白，應用于臨床可能引來一系列倫理和免疫風險，美國食品和藥品管理局已經嚴格限制了FBS應用于臨床。目前大量的研究在探索用富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)取代FBS用于MSCs的體外擴增[1]。

1 PRP的生物學特性

PRP是自體全血經離心后得到的血小板濃縮物，一般含有大量的血小板和少量的其他血細胞。血小板中含有豐富的生長因子，包括血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)，堿性成纖維細胞生長因子，胰島素樣生長因子，轉化生長因子β和血管內皮生長因子，這些細胞因子在細胞的增殖過程中都發(fā)揮著重要作用。PRP還含有人β防御素2，可以有效預防大腸埃希菌、巨大芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和奇異變形桿菌的感染[2]。

由于個體差異以及不同的制備過程，比如血小板的分離(兩次離心法或者血液成分除去法)，血小板的裂解(不同的溫度，凍融的次數)，血小板殘渣的去除(離心的速度和時間)等，會導致PRP中各細胞成分不同，生長因子的濃度和活性也各不相同[3]。與合成代謝相關的細胞因子PDGF、轉化生長因子β的濃度與血小板的濃度呈正相關，與分解代謝相關的細胞因子基質金屬蛋白酶9、白細胞介素1β的濃度與中性粒細胞的濃度呈正相關，此外白細胞介素1β的濃度還與單核細胞的濃度呈正相關[4]。

PRP應用前需用一定方法激活，通過血小板的黏附、凝集或者破裂將生長因子從血小板α顆粒中釋放出來。與此同時白細胞的破裂還伴有促炎性細胞因子的釋放[5]。目前常用凝血酶、氯化鈣或者反復凍融的方式對PRP進行激活。Textor等[6]將馬血樣本制備的PRP分別用自體凝血酶、牛凝血酶、氯化鈣和反復凍融等4種方式進行激活，酶聯(lián)免疫吸附測定PDGF-BB和轉化生長因子β1在PRP上清液中的濃度并進行統(tǒng)計學分析。氯化鈣激活的PRP中PDGF-BB水平顯著高于其他激活方式，而轉化生長因子β1在氯化鈣、牛凝血酶和反復凍融激活的PRP中釋放水平相當。自體凝血酶在激活血小板釋放生長因子方面顯著不如其他方法，因此不建議使用自體凝血酶作為PRP的激活劑。氯化鈣可釋放血小板中80%的PDGF，是一種經濟、高效的激活劑。考慮到牛凝血酶作為異種蛋白應用于臨床同樣存在病毒傳播、免疫抑制及凝血功能障礙等一系列潛在風險，而氯化鈣中的鈣離子對科研過程存在干擾，李洪濤等[7]嘗試用液氮凍融方法裂解血小板，經過比較發(fā)現(xiàn)，液氮凍融激活的洗滌血小板在一定濃度下可以顯著促進人牙髓細胞的增殖，而且比牛凝血酶激活的PRP效果更好。由此可見，針對不同的臨床應用，應采用不同的PRP制備方法。

迄今為止，國際上仍無公認的PRP制備方法，不同學者應用各自方法制備的PRP作出的實驗結論不具備可比性。對PRP進行標準化，使PRP的使用具有可靠性和重復性，保證科研和臨床質量，是一項亟需解決的工作。Amable等[8]發(fā)現(xiàn)，采用同一標準化流程制備和激活PRP，可避免由于靜脈血采集自不同志愿者引起的個體差異，使其中的生長因子含量保持相對一致水平。臨床工作中，一般采用將多人份來源的血小板混合，制備成混雜PRP以減少批次間的差異，并由此獲取大量的PRP。

2 PRP對干細胞體外增殖的作用

與FBS相比，PRP可以顯著促進骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)[9-10]、脂肪間充質干細胞[11-12]、肌肉干細胞[13]、肌腱干細胞[14]等的增殖，增加克隆形成率和纖維母細胞集落形成單位大小，減少達到匯合的時間。

國內多位學者對PRP促進牙髓干細胞增殖的作用進行了研究。趙晟楠等[15]用全自動血液細胞分析機采集人血小板并制備PRP，發(fā)現(xiàn)1%～20%PRP具有促進牙髓干細胞生長增殖的效應，其效果近似10%FBS。唐鳳勤等[16]應用兩步離心法制備PRP，研究結果顯示10%PRP促進牙髓細胞增殖作用強于相同濃度的FBS，并且明顯好于5%和20%的PRP。同時發(fā)現(xiàn)加入PRP后細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，由原來的長梭形，變?yōu)榘w減小、突起增加的極性細胞，將PRP去除后細胞又恢復原來的形態(tài)和生長速度。李威等[17]研究了不同濃度的PRP對犬牙髓成纖維細胞的促增殖作用，認為隨著PRP濃度的增加，對牙髓成纖維細胞的增殖作用經歷下面3個階段：①細胞的增殖與PRP的濃度呈正比；②PRP達到一定濃度，細胞的增殖反應呈飽和狀態(tài)，細胞的增殖與PRP的濃度無關；③當PRP的濃度繼續(xù)升高，細胞的增殖與PRP的濃度呈負相關。即PRP對細胞增殖的作用為低濃度時刺激生長、高濃度時抑制生長的雙向反應。段建民等[18]的研究也支持PRP只在一定濃度范圍內能夠促進牙髓細胞的增殖，他們發(fā)現(xiàn)將PRP中的血漿去除后對牙髓細胞增殖的促進作用更強，提示可能血漿成分中存在對抗牙髓細胞增殖的因素。

PRP的促增殖作用與其細胞成分密切相關。PDGF在促進細胞增殖方面可能起了關鍵的作用，用抗體選擇性阻斷PDGF后，PRP的促增殖作用被顯著抑制[19]。含有白細胞的PRP比不含白細胞的PRP釋放堿性成纖維細胞生長因子的速度更快，促進BMSCs增殖的能力更強[20]。臍帶血來源的PRP因含有更多的未分化細胞，其促增殖能力比靜脈血來源的PRP更強[21]。

PRP的促增殖作用依賴于各種生長因子的協(xié)同作用[22]。這些生長因子可以激活血小板源性生長因子受體/磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/核因子κB信號通路，提高旁分泌水平，促進細胞再生，使細胞耐受不良環(huán)境的能力更強，減緩細胞的凋亡[23]。

Pawitan等[24]分析了10篇用PRP替代FBS用于細胞培養(yǎng)的研究，大部分研究認為PRP用于骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSCs)和脂肪間充質干細胞培養(yǎng)時優(yōu)于或至少等效于FBS，對于PRP的最佳有效濃度沒有一致的結論，歸因于PRP制備方式的不同。

將人的成骨細胞和自體PRP共培養(yǎng)，經流式細胞術檢測，成骨細胞的細胞周期沒有發(fā)生改變，PRP的促進增殖作用隨著時間的延長慢慢消失，因而不會引起細胞的無序增殖[25]。Bieback等[26]的研究顯示，在BMSCs與PRP共培養(yǎng)的體系中未檢測到自發(fā)性的細胞轉化，在所有代數細胞中未檢測到端粒酶活性。PRP促進細胞增殖的作用與細胞的狀態(tài)有關，對不同年齡段志愿者的BMSCs進行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，老年志愿者來源的細胞增殖能力顯著降低[27]。這些研究說明PRP不改變細胞的性狀，不會導致細胞惡性變。

3 PRP維持干細胞干性的作用

干細胞的干性，即干細胞保持自我更新和多向分化的能力，有賴于干細胞的不對稱分裂。一個母代干細胞通過不對稱分裂產生一個子代干細胞和一個祖細胞，祖細胞再分化為終末細胞。干細胞在體外擴增時，一方面細胞群體數量要增加，更為重要的是要保持多向分化的能力。

通過比較血小板裂解物和FBS對馬的BMSCs體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在兩種培養(yǎng)基中細胞的產出率、成纖維細胞集落生成單位、細胞倍增時間等方面無明顯差異；此外，兩種培養(yǎng)基中的細胞均可檢測出干細胞的標記基因Sox2、Oct4和Klf4，證明兩種培養(yǎng)基中的細胞均保持了干細胞特性[28]。

利用PRP替代FBS對脂肪干細胞進行體外培養(yǎng)，細胞具有更高的增殖率，且終生保持干細胞特異性表面標志物和多向分化能力[29]。在對肌肉干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，PRP在促進細胞增殖和維持多向分化能力的同時，還保持了干細胞特有的免疫抑制性[22]。

但是，PRP培養(yǎng)的MSCs細胞形態(tài)較小，大多表現(xiàn)為紡錘形，且多成簇聚集。PRP對干細胞表面的黏附因子可能有一定的影響，Bernardo等[30]的研究發(fā)現(xiàn)PRP培養(yǎng)的BMSCs與培養(yǎng)瓶附著較松，在從培養(yǎng)瓶上分離時用胰蛋白酶水解時間較短。但另一針對脂肪干細胞的研究卻得出相反的結論，認為PRP培養(yǎng)的脂肪干細胞與塑料培養(yǎng)瓶的附著更緊[31]。

4 結 語

FBS從胎牛體內獲取，需要將懷孕的母牛處死，目前的制取方法會導致大量胎牛的死亡；FBS的成分不確定，每一批次間各種成分的含量千差萬別，因此在科學研究中容易造成誤差，影響試驗的可重復性；FBS作為一種外源性血清，應用于臨床可能引起免疫排斥反應，甚至可能將牛的病毒、細菌等病原體傳播至人。所以，MSCs應用于臨床前不宜用FBS進行體外培養(yǎng)。從目前研究成果可以看出，大部分的研究者認為PRP可以替代FBS應用于MSCs的體外擴增。PRP在促進MSCs大量增殖的過程中，不改變細胞的性狀，維持MSCs的免疫抑制能力和多向分化能力。下一步，應對PRP的制備方法和性狀進行標準化，進一步提高科研和臨床工作的可靠性和重復性，以利于大量制備和商業(yè)推廣。

[1] Iudicone P,Fioravanti D,Bonanno G,etal.Pathogen-free,plasma-poor platelet lysate and expansion of human mesenchymal stem cells[J].J Transl Med,2014,12(1):28.

[2] Tohidnezhad M,Varoga D,Wruck CJ,etal.Platelets display potent antimicrobial activity and release human beta-defensin 2[J].Platelets,2012,23(3):217-223.

[3] Weibrich G,Kleis WK,Hitzler WE,etal.Comparison of the platelet concentrate collection system with the plasma-rich-in-growth-factors kit to produce platelet-rich plasma:a technical report[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2005,20(1):118-123.

[4] Sundman EA,Cole BJ,Fortier LA.Growth factor and catabolic cytokine concentrations are influenced by the cellular composition of platelet-rich plasma[J].Am J Sports Med,2011,39(10):2135-2140.

[5] Dunkel B,Bolt DM,Smith RK,etal.Stimulus-dependent release of tissue-regenerating factors by equine platelets[J].Equine Vet J,2012,44(3):346-354.

[6] Textor JA,Tablin F.Activation of equine platelet-rich plasma:comparison of methods and characterization of equine autologous thrombin[J].Vet Surg,2012,41(7):784-794.

[7] 李洪濤,段建民,張宏斌,等.液氮凍融洗滌血小板對人牙髓細胞增殖的影響[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2010,20(6)：314-317.

[8] Amable PR,Carias RB,Teixeira MV,etal.Platelet-rich plasma preparation for regenerative medicine:optimization and quantification of cytokines and growth factors[J].Stem Cell Res Ther,2013,4(3):67.

[9] Doucet C,Ernou I,Zhang Y,etal.Platelet lysates promote mesenchymal stem cell expansion:a safety substitute for animal serum in cell-based therapy applications[J].J Cell Physiol,2005,205(2):228-236.

[10] Muraglia A,Ottonello C,Spanò R,etal.Biological activity of a standardized freeze-dried platelet derivative to be used as cell culture medium supplement[J].Platelets,2013.

[11] 楊世茂,王明國,李靜,等.富血小板纖維蛋白與富血小板血漿體外釋放生長因子的比較及其對脂肪干細胞增殖分化的影響[J].華西口腔醫(yī)學雜志,2012,30(6):641-649.

[12] Cholewa D,Stiehl T,Schellenberg A,etal.Expansion of adipose mesenchymal stromal cells is affected by human platelet lysate and plating density[J].Cell Transplant,2011,20(9):1409-1422.

[13] Huang S,Wang Z.Platelet-rich plasma-derived growth factors promote osteogenic differentiation of rat muscle satellite cells:in vitro and in vivo studies[J].Cell Biol Int,2012,36(12):1195-1205.

[14] Chen L,Dong SW,Tao X,etal.Autologous platelet-rich clot releasate stimulates proliferation and inhibits differentiation of adult rat tendon stem cells towards nontenocyte lineages[J].J Int Med Res,2012,40(4):1399-1409.

[15] 趙晟楠,劉文菲,張振庭.富血小板血漿對牙髓干細胞增殖及成骨活性的影響[J].中華口腔醫(yī)學雜志,2013,48(3):177-182.

[16] 唐鳳勤,鄒德榮,陸家瑜,等.富血小板血漿促進人牙髓細胞增殖的實驗研究[J].口腔醫(yī)學,2009,29(3)：137-141.

[17] 李威,閆福華,盧友光,等.富血小板血漿對牙髓成纖維細胞附著、增殖的影響[J].口腔醫(yī)學研究,2004,20(2)：126-128.

[18] 段建民,菊地寬高,汪維建,等.血小板血漿對人牙髓細胞增殖的影響[J].牙體牙髓牙周病學雜志,2006,16(4):188-191.

[19] Li H,Usas A,Poddar M,etal.Platelet-rich plasma promotes the proliferation of human muscle derived progenitor cells and maintains their stemness[J].PLoS One,2013,8(6):e64923.

[20] Perut F,Filardo G,Mariani E,etal.Preparation method and growth factor content of platelet concentrate influence the osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells[J].Cytotherapy,2013,15(7):830-839.

[21] Murphy MB,Blashki D,Buchanan RM,etal.Adult and umbilical cord blood-derived platelet-rich plasma for mesenchymal stem cell proliferation,chemotaxis,and cryo-preservation[J].Biomaterials,2012,33(21):5308-5316.

[22] Assoian RK,Grotendorst GR,Miller DM,etal.Cellular transformation by coordinated action of three peptide growth factors from human platelets[J].Nature,1984,309(5971):804-806.

[23] Peng Y,Huang S,Wu Y,etal.Platelet rich plasma clot releasate preconditioning induced p13K/AKT/NFκB signaling enhances survival and regenerative function of rat bone marrow mesenchymal stem cells in hostile microenvironments[J].Stem Cells Dev,2013(24):3236-3251.

[24] Pawitan JA.Platelet rich plasma in xeno-free stem cell culture:the impact of platelet count and processing method[J].Curr Stem Cell Res Ther,2012,7(5):329-335.

[25] García-Martínez O,Reyes-Botella C,Díaz-Rodríguez L,etal.Effect of platelet-rich plasma on growth and antigenic profile of human osteoblasts and its clinical impact[J].J Oral Maxillofac Surg,2012,70(7):1558-1564.

[26] Bieback K,Hecker A,Koca?mer A,etal.Human alternatives to fetal bovine serum for the expansion of mesenchymal stromal cells from bone marrow[J].Stem Cells,2009,27(9):2331-2341.

[27] Vogl M,Fischer J,J?ger M,etal.Can thrombin-activated platelet releasate compensate the age-induced decrease in cell proliferation of MSC?[J].J Orthop Res,2013,31(11):1786-1795.

[28] Seo JP,Tsuzuki N,Haneda S,etal.Comparison of allogeneic platelet lysate and fetal bovine serum for in vitro expansion of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells[J].Res Vet Sci,2013,95(2):693-698.

[29] Kocaoemer A,Kern S,Klüter H,etal.Human AB serum and thrombin-activated platelet-rich plasma are suitable alternatives to fetal calf serum for the expansion of mesenchymal stem cells from adipose tissue[J].Stem Cells,2007,25(5):1270-1278.

[30] Bernardo ME,Avanzini MA,Perotti C,etal.Optimization of in vitro expansion of human multipotent mesenchymal stromal cells for cell-therapy approaches:further insights in the search for a fetal calf serum substitute[J].J Cell Physiol,2007,211(1):121-130.

[31] Naaijkens BA,Niessen HW,Prins HJ,etal.Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications[J].Cell Tissue Res,2012,348(1):119-130.