張新穎(綜述)，婁 燕※，董長征(審校)

(河北省人民醫(yī)院 1兒科， 2神經外科，石家莊 050051)

癲癇是由腦部神經元異常高度同步化放電所致的突然性、反復性和短暫性的腦功能障礙綜合征，臨床表現為運動、感覺、意識、精神等多方面的功能障礙[1]，可以導致智力水平下降，學習記憶能力不足等[2-3]，嚴重影響患者的身心健康及正常生活質量。其發(fā)病機制復雜，治療較為困難。國內外研究者已經從突觸可塑性、二次打擊及遺傳學等方面對癲癇進行了廣泛深入的研究，對其復雜的發(fā)病機制有了一定認識，但尚未取得突破性進展。海馬苔蘚纖維出芽(mossy fiber sprouting,MFS)是人類顳葉癲癇及各類癲癇模型中普遍存在的病理現象[4-6]，與癲癇的發(fā)生發(fā)展密切相關，因而MFS機制也成為癲癇研究的熱點之一[7-8]。研究者最近發(fā)現細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)與其調節(jié)蛋白p35、p25等能夠通過參與海馬MFS，從而促進癲癇的發(fā)生[9]，引起了科學家們的普遍關注。

1 Cdk5的發(fā)現

真核細胞的細胞分裂周期(cell division cycle,Cdc)受磷酸化/脫磷酸化事件調控，參與調控的分子成員由Cdc2同源催化亞單位和屬于細胞周期蛋白家族成員的調節(jié)亞單位組成。由于這些激酶需要與細胞周期蛋白結合才具有激酶活性，因此稱為細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,Cdks)。Cdk5從1992年開始被多個實驗室先后發(fā)現，并被予以不同的命名。Hellmich等[10]從大鼠腦組織cDNA文庫中克隆出一種細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶，稱為神經元Cdc2樣蛋白激酶，其氨基酸序列與小鼠Cdk1同源性為58%，與人類Cdk2同源性為61%。同一時期，Meyerson等[11]在尋找真核細胞周期中可能起重要作用的Cdks時，以對應于Cdc2保守序列的簡并引物進行海拉細胞mRNA的熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應，發(fā)現了Cdk5蛋白激酶。同一年，Lew等[12]在牛的腦組織中發(fā)現了結構上與Cdc2相似的分子，稱之為腦脯氨酸-限定性蛋白激酶。而Ishiguro等[13]所發(fā)現的與微管相關的Tau蛋白激酶Ⅱ亦為同一物質。最終在1993年，Kobayashi等[14]將這個相對分子質量為30×103有活性的蛋白激酶亞單位命名為Cdk5。

2 Cdk5激酶

Cdk5基因被映射到第7號染色體上。在7q36，它是一個包含12個外顯子的3.95 kb(對應于987 bp Cdk5轉錄物)的長DNA。Cdk5蛋白是一個相對分子質量為33×103的分子，只有與激活劑結合后才具有激酶活性?；罨腃dk5能磷酸化毗鄰脯氨酸殘基上游的絲氨酸/蘇氨酸。

Cdk5是Cdks家族成員，在結構上與其他成員相似。像真核生物中的大多數蛋白激酶一樣，Cdk5也具有與調節(jié)相關的催化域。這個催化域有一個由β-折疊構成的N端區(qū)域和α-螺旋組成的C區(qū)，兩者之間有ATP結合位點。α-螺旋結構被稱作Cdc2相關激酶結構，起源于多肽序列。延續(xù)的20個氨基酸殘基中心位于N和C區(qū)之間，形成一個能夠進行磷酸轉移的構象，稱為活化環(huán)。盡管結構很相似，但Cdk5的活化方式卻與其他Cdks不盡相同。

Cdk5在多種神經元功能中扮演著重要角色，包括神經元遷移分化、存活及突觸的發(fā)生、信息傳遞、可塑性[15-16]等，并可能通過下游底物的磷酸化發(fā)揮作用。

3 Cdk5激活劑

3.1p35/p39 p35是Cdk5的調節(jié)亞基，Cdk5只有與其活性調節(jié)亞基結合，才能表現出催化活性。經鑒定p39(神經元Cdk5激活劑亞型)與p35有57%的同源序列。突變研究顯示，雖然p39能掩飾p35缺乏，但只能代償p35的部分功能，而并非全部[17]。p35/p39復合物突變大鼠與Cdk5缺陷大鼠表現型基本相同，暗示在發(fā)育過程中，兩種調節(jié)因子對Cdk5的影響是不能被其他分子代替的。Cdk5的這兩個非細胞周期調節(jié)蛋白與激活其他Cdks的經典細胞周期調節(jié)蛋白不存在序列相似性，但三維結構卻與其基序相似。p35/p39主要定位于細胞膜。Cdk5通常與其激活劑和底物區(qū)域化。但是，Fu等[18]的一個研究顯示p35通過核轉運蛋白β、核轉運蛋白5和核轉運蛋白7動態(tài)定位于細胞核和細胞質之間，并可以與它們直接交換進入細胞核。

3.2p25 p25，一個相對分子質量為25×103的蛋白，是p35被中性鈣蛋白裂解后產生的C端片段。p35壽命較短(半衰期<30 min)，而p25與p35不同，它不容易降解，半衰期是p35的2～3倍。而且，p25也可以與Cdk5結合并使其激活，改變它的細胞定位和底物特異性。因此，裂解片段p25能夠維持Cdk5的過度激活狀態(tài)，而這種過度激活狀態(tài)通常與神經毒性相關。與p35相似，在細胞內也檢測到了p39的一個裂解片段p29，亦可導致Cdk5失調[19]。

4 Cdk5激酶活性調節(jié)

4.1Cdk5激活機制 Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，主要在神經元中發(fā)揮作用，通過與調節(jié)亞單位p35，p25(p35的一個C端片段)或p39結合激活。在可再生細胞，大多數Cdks是在促進細胞周期進程中發(fā)揮作用的，而Cdk5活性卻主要在有絲分裂后神經元被檢測到。這是因為雖然Cdk5本身在許多細胞和組織廣泛表達，但Cdk5活化亞單位p35和p39卻主要在分化神經元表達。Cdk5與其他Cdks的氨基酸序列相似性可高達50%～60%，而且在結構上與Cdk2相似[20]。盡管p35和p39的氨基酸序列與細胞周期蛋白類不盡相同，卻能激活Cdk5，這主要是因為Cdk5結合p35結構域與Cdk2結合細胞周期蛋白A的空間結構是相似的[19]。p35和p25與細胞周期蛋白在結構和序列方面的差別促成了Cdk5-p35的獨特激活機制。特別是，磷酸化激活和細胞膜相關性是Cdk5的獨特性質。

4.2Cdk5活性被p35合成和降解調節(jié) 腦組織中Cdk5的量要遠遠多于p35，這個研究結果表明Cdk5激酶活性主要是由神經元中可利用的p35蛋白量決定的[21]。而p35蛋白量是由合成和降解之間的平衡控制的。用培養(yǎng)的神經元和成神經瘤細胞(他們可在體外分化成神經元樣細胞)研究p35的合成。在培養(yǎng)的皮層神經元，腦源性神經營養(yǎng)因子能夠刺激p35表達[22]。在PC12細胞，神經生長因子能夠強烈誘導p35表達，Cdk5激酶活性也隨之大大增強。神經生長因子主要通過細胞外信號調節(jié)激酶途徑誘導p35合成。相關研究報道在皮層發(fā)育過程中p35是轉錄因子熱激蛋白2的靶點[23]。在細胞外基質蛋白作用下，p35的合成也增強，但是相對緩慢。當小腦神經元在層黏連蛋白存在條件下培養(yǎng)時，p35蛋白水平增加，導致Cdk5活性增加。在維甲酸存在時人骨髓神經母細胞瘤細胞株細胞分化，層黏連蛋白誘導p35的mRNA和蛋白高水平表達，隨后Cdk5活性增加?？傊?，p35的合成能夠被細胞外信號包括營養(yǎng)因子和基質蛋白等誘導，從而導致Cdk5激活。

4.3Cdk5通過蛋白酶體降解p35失活 p35是短效蛋白，半衰期<30 min。在C33A細胞、Cos7細胞和神經元均檢測到了p35的泛素化。p35中不包含與細胞周期蛋白B和A(后期促進復合物/周期小體)破壞作用框相應的氨基酸序列。更確切地說，p35的分解可被岡田軟海綿酸(一種蛋白磷酸酶1和2A抑制劑)刺激，被Cdk5在Thr138位點的磷酸化觸發(fā)。而與p35相似的細胞周期蛋白D和E，是被泛素連接酶家族的一個成員SCF復合物(SKP1-CUL1-F-box蛋白)誘導磷酸化后降解。在皮質神經元谷氨酸鹽能夠導致p35降解。谷氨酸鹽處理可短暫激活Cdk5-p35并磷酸化p35，導致其泛素化后降解。與之相反，p35的穩(wěn)定性被蛋白激酶Cδ在Ser59、Ser65或Ser124位點的磷酸化調節(jié)。磷酸化可抑制p35的泛素化，從而抑制了其降解。在腦發(fā)育神經元遷移過程中觀察到了這種作用。因此，p35降解是神經元活性的一個重要調節(jié)機制。

5 Cdk5/p35在癲癇相關病理改變中的作用

5.1Cdk5/p35在中樞神經系統(tǒng)中的作用 雖然Cdk5在哺乳動物組織和細胞中廣泛表達，但是由于其主要的調節(jié)蛋白p35主要在中樞神經系統(tǒng)中表達，所以Cdk5相關的蛋白激酶活性也局限在腦內。Cdk5/p35具有十分廣泛的生理作用，可以通過對tau蛋白磷酸化的調控來限定神經元極性，參與神經元遷移過程，在神經系統(tǒng)發(fā)育和再生中發(fā)揮作用，還能磷酸化多種含有賴氨酸-絲氨酸-脯氨酸重復序列的細胞骨架蛋白，包括神經纖維、微管相關蛋白tau及有絲分裂原激活蛋白等，參與神經元骨架中微管的裝配，以提高微管的穩(wěn)定性，在神經元可塑性中起著重要作用[15]。

5.2Cdk5/p35在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用

5.2.1MFS在癲癇發(fā)生發(fā)展中的作用 癲癇發(fā)作可以導致神經元軸突出芽及內分子層失神經傳入，伴隨的MFS能夠阻斷其與靶細胞之間的聯系，促使這種異常出芽回返至上顆粒層，并與該層中間神經元樹突和密集的顆粒細胞形成新的突觸聯系[24]。新建立的突觸聯系改變了內分子層及門區(qū)的局部環(huán)路，形成異常興奮灶，使發(fā)作敏感性增加，誘導癲癇再次發(fā)作，這種惡性循環(huán)致使癲癇反復復發(fā)，成為難治性癲癇。有學者研究顯示，MFS的變化趨勢與戊四氮點燃效應的逐步建立相一致，且在大鼠癲癇發(fā)作前海馬MFS已經出現[25]，說明MFS并非僅是癲癇發(fā)生的結果，MFS所反映的突觸重建在促進癲癇發(fā)生和反復發(fā)作中起著重要作用。

一般認為海馬CA3區(qū)神經元死亡可以誘發(fā)MFS，但過多的神經元丟失也會使出芽的苔蘚纖維缺乏靶向，不利于在該區(qū)域進行突觸重建，而主要投射向齒狀回內分子層。在戊四氮點燃過程中，SD大鼠很少出現癲癇持續(xù)狀態(tài)，海馬CA3區(qū)只有少量神經元受到損傷，尚有足夠數量健存的錐體細胞，能夠為異位投射的苔蘚纖維提供頂樹突，建立新的突觸聯系。因此，除神經元死亡能夠誘發(fā)MFS外，還可能存在其他的出芽機制。

5.2.2Cdk5/p35通過參與MFS促進癲癇發(fā)生 田發(fā)發(fā)等[26]研究發(fā)現，在戊四氮點燃大鼠模型，海馬CA3區(qū)MFS的變化趨勢與Cdk5及其調節(jié)亞基p35的mRNA及蛋白表達水平相一致，提示海馬Cdk5/p35可能通過參與苔蘚纖維出芽，從而促進癲癇的發(fā)生。

Cdk5是脯氨酸限定性Ser/Thr蛋白激酶，參與神經元遷移分化、突觸的生長及信息傳遞等，是許多細胞骨架蛋白成分的主要磷酸化酶。Cdk5主要通過與調節(jié)亞單位p35或p39結合而被激活，p35主要分布于中樞神經系統(tǒng)梨狀皮質、海馬(CA1、CA3、齒狀回)、杏仁核和內嗅皮質的分化神經元中(尤以海馬內濃度最高)，是Cdk5主要的調節(jié)亞基，又被稱為神經元Cdk5激活劑。實驗表明，Cdk5與其調節(jié)蛋白p35在癲癇的發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用[25]。Cdk5/p35共同參與了神經元骨架蛋白-tau蛋白的磷酸化過程，導致其磷酸化水平的變化，進而誘發(fā)海馬MFS和突觸重建[27]，從而在癲癇的反復發(fā)作中起重要作用。

Tomizawa等[28]制備電驚厥大鼠癲癇模型，并在點燃過程中觀察Cdk5蛋白激酶活性及其調節(jié)亞基p35表達的變化，發(fā)現Cdk5激酶活性隨著癲癇發(fā)作級別的增加先升后降，p35的表達變化趨勢與Cdk5激酶活性的變化相一致；外科手術切除的顳葉癲癇海馬硬化標本中Cdk5活性也有顯著升高[29]，提示Cdk5/p35的確參與了癲癇的發(fā)生。與此同時，在電點燃過程中，非磷酸化tau蛋白呈逐漸下降趨勢，至5級發(fā)作時最低，而磷酸化tau蛋白在各級癲癇發(fā)作中均有顯著的增高，以3級發(fā)作時升高最顯著。Johanna等[30]在劇烈和長期發(fā)作的癥狀性癲癇患者腦脊液中檢測到總tau(T-tau)和磷酸化tau(P-tau)水平升高。T-tau和P-tau在戊四氮點燃進程中均增加，并且T-tau和P-tau的亞細胞定位與Cdk5/p35顯示相同的變化規(guī)律[25]。由此可見，Cdk5/p35可能是通過參與tau蛋白過度磷酸化來影響海馬MFS和突觸重建，進一步促進癲癇的發(fā)生和發(fā)展。另外，Cdk5還可以通過突觸后致密物(PSD-95)、蛋白磷酸酶抑制劑1等的磷酸化來參與海馬的MFS過程。

Cdk5和p35的mRNA和蛋白在大鼠海馬廣泛表達，主要分布于CA3區(qū)和CA1區(qū)的錐體細胞、門區(qū)神經元和齒狀回顆粒細胞，在CA3區(qū)MFS過程中Cdk5的mRNA和蛋白表達，2周內主要聚集在胞質，4～6周主要在胞膜和突起。MFS形成早期，胞質內表達的Cdk5，在胞質運輸中起一定作用，而在MFS高峰期，胞膜和突起中表達的Cdk5，主要對突軸運輸起作用，由此可推測Cdk5促進MFS過程可能與其在細胞內的分布變化亦有一定關系。

6 結 語

Cdk5作為Cdks家族的一個特殊成員，不參與細胞周期調控，而是通過與其調節(jié)亞單位p35結合，在癲癇發(fā)作中發(fā)揮重要作用。其機制可能是：Cdk5/p35復合物形成調節(jié)Cdk5活性，通過使tau蛋白過度磷酸化來誘發(fā)海馬MFS和突觸重建，形成異常興奮性環(huán)路，從而促進癲癇的發(fā)生和發(fā)展。這些研究成果顯示，進一步深入研究Cdk5/p35的結構和功能，及其在癲癇發(fā)病機制中的作用，不僅對認識癲癇患者的MFS病理改變機制具有重要的意義，同時還將為臨床防治癲癇提供一些新的思路。

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