孫婧悅(綜述)，何敬東(審校)

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院腫瘤科，江蘇 淮安 223300)

DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在CpG二核苷酸中將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上形成5-甲基胞嘧啶。該過程不涉及核苷酸序列的變化，而屬于表觀遺傳學(xué)改變的范疇，是一種具有可逆性和可遺傳性的基因修飾方式。在整個(gè)人類的基因組中，CpG二核苷酸非均勻分布，并且有兩種存在方式：一種為散在分布且處于甲基化狀態(tài)；另一種富含CpG，長(zhǎng)度>200 kb，呈非甲基化狀態(tài)，即CpG島[1]。在惡性腫瘤細(xì)胞中，DNA異常甲基化主要表現(xiàn)為廣泛低甲基化和局部CpG島啟動(dòng)子的高甲基化，目前后者的報(bào)道相對(duì)較多[2]。相關(guān)研究表明，廣泛低甲基化會(huì)引起染色質(zhì)缺失及重組，從而導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，這種不穩(wěn)定性的累加最終促使腫瘤的發(fā)生[3]。局部高甲基化通常發(fā)生在抑癌基因CpG島的啟動(dòng)子區(qū)域，使抑癌基因表達(dá)沉默，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4]。胃癌中存在很多基因的異常甲基化，在疾病進(jìn)展的各個(gè)階段均可檢測(cè)到DNA異常甲基化的存在[5]。因此，檢測(cè)胃癌相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，可以為胃癌的發(fā)生、發(fā)展、早期診斷、藥物治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的思路。

1 DNA異常甲基化與胃癌的發(fā)生、發(fā)展

胃癌的發(fā)生、發(fā)展伴隨有許多基因的低甲基化和高甲基化。前者主要涉及原癌基因及廣泛基因組的低甲基化，后者主要指抑癌基因CpG島啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化。目前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道與胃癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的甲基化基因，如RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3、人類錯(cuò)配修復(fù)基因1、金屬蛋白酶組織抑制物3、抑癌基因p16等，它們的功能分別是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、參與DNA修復(fù)、涉及細(xì)胞生長(zhǎng)分化、調(diào)控細(xì)胞周期等多方面[5-8]。上述基因的異常甲基化在腫瘤細(xì)胞形成的各個(gè)階段發(fā)揮不同的作用，下面重點(diǎn)介紹幾個(gè)新近發(fā)現(xiàn)與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因。

1.1早期B細(xì)胞因子3 早期B細(xì)胞因子3(early B-cell factor-3，EBF3)是一種抑癌基因，位于人類染色體10q26.3區(qū)域，由551個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對(duì)分子質(zhì)量約60×103，含有家族性非典型鋅指及螺旋結(jié)構(gòu)，其基本功能是調(diào)控細(xì)胞分裂周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。EBF3啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默，被認(rèn)為是胃癌的發(fā)病因素之一，目前已在胃癌組織中得到了證實(shí)。Kim等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在104例胃癌組織中，有42例檢測(cè)到了EBF3啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，甲基化率為40.4%，而EBF3在正常的胃黏膜組織中，未發(fā)現(xiàn)異常甲基化。功能分析表明，EBF3抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)細(xì)胞周期停滯及凋亡。因此，在胃癌組織中高甲基化狀態(tài)的EBF3導(dǎo)致蛋白表達(dá)下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)不受調(diào)控，從而引起胃癌的發(fā)生與發(fā)展。

1.2原鈣黏素10 原鈣黏素10(protocadherin 10，PCDH10)是一種重要的抑癌基因，位于人類染色體4q28.3區(qū)域，長(zhǎng)度約42.26 kb，為原鈣黏素細(xì)胞黏附分子家族的成員之一，其基本功能是參與鈣依賴型細(xì)胞間黏附，介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Yu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在17種胃癌細(xì)胞系中有16種檢測(cè)到PCDH10表達(dá)沉默或下調(diào)。此外，在104例胃癌患者中，85例存在PCDH10高甲基化，甲基化率為82%，而相對(duì)應(yīng)的104例癌旁組織中，僅有38例檢測(cè)到PCDH10高甲基化，甲基化率為37%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PCDH10重新獲得表達(dá)后，能夠抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻止細(xì)胞侵襲生長(zhǎng)。PCDH10不僅參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，在其他腫瘤的形成中也有作用，已有文獻(xiàn)報(bào)道，PCDH10異常甲基化與結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[11-12]。

1.3促生長(zhǎng)素抑制素 促生長(zhǎng)素抑制素(somatostatin，SST)為一種腸肽，可以阻止胃癌等多種癌癥中腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其廣泛分布于胃腸道，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起重要作用。有研究表明，在人類惡性腫瘤中，SST有抑癌基因的功能，可以通過調(diào)控生長(zhǎng)因子和激素的釋放、減少血管形成等機(jī)制抑制腫瘤的生長(zhǎng)[13]。Shi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在51例胃癌組織中，通過定量的甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SST啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平，發(fā)現(xiàn)23例SST發(fā)生高甲基化，甲基化率為45.1%，而相對(duì)應(yīng)的51例正常胃黏膜組織中，用同樣的方法只檢測(cè)出2例SST高甲基化；此外分別用放射免疫分析法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)SST蛋白及信使RNA水平，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的SST表達(dá)水平顯著低于正常胃黏膜組織。這一研究提示，在胃癌中基因高甲基化是SST表達(dá)沉默的主要原因，而SST作為抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的因子，其表達(dá)下調(diào)或缺失會(huì)導(dǎo)致胃癌等消化道惡性腫瘤的發(fā)生。

2 DNA異常甲基化與胃癌的早期診斷

胃癌在全球具有很高的發(fā)病率和病死率，盡管診斷技術(shù)有所改進(jìn)，但仍有很多患者在疾病晚期才能被確診，而這類患者的生存期較短，預(yù)后相對(duì)較差。所以，胃癌的早期診斷顯得尤為重要。目前，很多胃癌相關(guān)基因的異常甲基化已經(jīng)被證實(shí)，越來越多的研究表明，在胃癌形成的早期階段，DNA的異常甲基化導(dǎo)致表達(dá)沉默的現(xiàn)象便已出現(xiàn)[15]。因此，通過甲基化特異性實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)、亞硫酸氫鹽測(cè)序法、亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序法等技術(shù)測(cè)定相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)，對(duì)于胃癌的早期診斷有一定的臨床價(jià)值。

2.1血漿中游離DNA異常甲基化與胃癌早期診斷 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，在胃癌患者的血漿中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)死亡相關(guān)蛋白激酶K(death-associated protein kinase，DAPK)、上皮鈣黏素、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1、抑癌基因p15、p16等基因的異常甲基化，它們是由胃癌細(xì)胞中參與循環(huán)的核酸釋放入血漿，與胃癌組織中的基因異常甲基化密切相關(guān)，可以作為一類生物標(biāo)志物，應(yīng)用于胃癌的診斷[16]。Lu等[5]研究發(fā)現(xiàn)，血漿中游離RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3的高甲基化在胃癌的早期診斷及術(shù)后評(píng)估中有重要的意義。此外，p16啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的早期分子事件，因此在血漿中檢測(cè)p16基因的甲基化水平可以用來診斷早期胃癌[17]。同胃癌組織類似，胃癌患者血漿中也存在多種基因共同發(fā)生異常甲基化[18]。

2.2胃液中脫落腫瘤細(xì)胞DNA異常甲基化與胃癌早期診斷 由于DNA在胃酸的作用下容易發(fā)生變性，因此胃液脫落細(xì)胞檢查不能作為胃癌診斷的一個(gè)手段。然而胃液中可以找到很多黏膜細(xì)胞，所以在胃液中尋找胃癌脫落細(xì)胞，并檢測(cè)其DNA甲基化狀態(tài)，可能成為胃癌早期診斷的一種非侵入性方法。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在胃癌患者的胃液中成功檢測(cè)到了MINT25、RORA、膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、整合素-金屬蛋白水解酶23、PRDM5以及髓細(xì)胞白血病因子1基因的異常甲基化，其中MINT25基因的甲基化在胃癌的早期診斷中具有較高的靈敏度(90%)和特異度(96%)[19]。這些研究說明，檢測(cè)胃液中脫落胃癌細(xì)胞的DNA甲基化水平，可以為胃癌早期診斷提供新的選擇。

3 DNA異常甲基化與胃癌的藥物治療

DNA異常甲基化是一種可逆的表觀遺傳學(xué)改變，在胃癌細(xì)胞中許多抑癌基因發(fā)生高甲基化及表達(dá)沉默，因此通過去甲基化藥物可以使抑癌基因脫甲基化，重新獲得表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。基因高甲基化是通過DNMT的作用發(fā)生的。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT的異常表達(dá)在包括胃癌等腫瘤的形成中起著重要作用[20]。因此，DNMT抑制劑被認(rèn)為是治療腫瘤的新型藥物。DNMT抑制劑主要有兩大類，核苷酸類與非核苷酸類[21]。有關(guān)核苷酸類的研究報(bào)道較多，以5-氮雜胞苷(阿扎胞苷)和5-氮雜-2′-脫氧胞苷(地西他濱)為代表，分別于2004年和2006年被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)，用于骨髓增生異常綜合征和急性粒細(xì)胞白血病的治療[22]。但是，目前尚未開展針對(duì)胃癌藥物治療的臨床試驗(yàn)。非核苷酸類DNMT抑制劑研究較少，其結(jié)構(gòu)多變，根據(jù)抑制機(jī)制的不同而不同，包括生物類黃酮、染料木黃酮等，但是均未進(jìn)入臨床研發(fā)。因此，非核苷酸類DNMT抑制劑應(yīng)用于腫瘤的藥物治療，仍需要進(jìn)一步探索和努力。

此外，DNA異常甲基化還與胃癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性相關(guān)。一些化療藥物通過損傷腫瘤細(xì)胞的DNA從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，凋亡相關(guān)基因一旦出現(xiàn)異常甲基化，導(dǎo)致凋亡信號(hào)途徑失活，則化療藥物不易引起腫瘤細(xì)胞凋亡，該現(xiàn)象被認(rèn)為與化療耐藥相關(guān)。Sugita等[23]研究報(bào)道，在80例胃癌術(shù)后接受氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化學(xué)治療患者標(biāo)本中，用甲基化特異性實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bcl-2/腺病毒E1B19 kD相互作用蛋白3和DAPK的甲基化狀態(tài)，兩者的甲基化率分別為39%、41%，甲基化的Bcl-2/腺病毒E1B19 kD相互作用蛋白3和(或)DAPK對(duì)氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療藥物敏感性較未發(fā)生甲基化者差，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示兩者對(duì)氟尿嘧啶類化療藥物耐藥。Ivanova等[24]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，其甲基化及表達(dá)狀態(tài)有望成為胃癌細(xì)胞順鉑耐藥的一個(gè)標(biāo)志，針對(duì)BMP4的靶向治療能增加胃癌細(xì)胞的敏感性，并且BMP4的表達(dá)對(duì)奧沙利鉑沒有交叉耐藥現(xiàn)象。該研究提示，BMP4表達(dá)陽(yáng)性的患者臨床上可以使用奧沙利鉑替代順鉑進(jìn)行有效的化學(xué)治療。上述DNA異常甲基化與藥物敏感性研究可以應(yīng)用于臨床指導(dǎo)個(gè)體化用藥，為胃癌患者選擇最有效的化學(xué)治療方案。

4 DNA異常甲基化與胃癌的預(yù)后評(píng)價(jià)

胃癌患者的預(yù)后取決于確診時(shí)的臨床分期及有效的治療方式，因此早期診斷及最佳的治療是胃癌患者預(yù)后最好的保證。DNA異常甲基化不僅有助于胃癌早期診斷及化療藥物的個(gè)體化選擇，而且對(duì)患者的預(yù)后有一定的提示作用。Bae等[25]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)散在核元件1(long interspersed nucleotide element-1，LINE-1)甲基化水平依照腸上皮化生、胃腺瘤、胃癌的發(fā)展順序逐漸下降，并且LINE-1低甲基化與不良的預(yù)后密切相關(guān)。Shigaki等[26]也發(fā)現(xiàn)，LINE-1在胃癌組織中甲基化水平較正常胃黏膜組織低，LINE-1低甲基化提示總體生存率較低，預(yù)后不良。2013年，有韓國(guó)學(xué)者報(bào)道，提取53例行胃癌切除術(shù)患者的術(shù)前及術(shù)后10 d血漿DNA，甲基化特異性實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)p16甲基化水平，得出甲基化率分別為79.2%和54.7%，且術(shù)后p16甲基化消失者較術(shù)后未消失者的生存期更長(zhǎng)久[27]說明，p16異常甲基化與患者的預(yù)后有一定的關(guān)聯(lián)性。

5 小 結(jié)

DNA異常甲基化在胃癌的發(fā)生和發(fā)展、早期診斷、藥物治療及預(yù)后評(píng)價(jià)中均起到一定的作用，但是仍然存在許多問題。胃癌患者體內(nèi)有多種基因發(fā)生異常甲基化，而目前甲基化檢測(cè)手段很有限，需要進(jìn)一步提高其敏感性和特異性，以便早期診斷胃癌，盡早實(shí)現(xiàn)針對(duì)某一基因的靶向治療，延長(zhǎng)胃癌患者的生存期。另外，基因異常甲基化是一種可逆的表觀遺傳學(xué)改變，可以認(rèn)為DNMT抑制劑治療腫瘤同樣是一個(gè)可逆的過程，經(jīng)治療一段時(shí)間后，基因可能會(huì)恢復(fù)到原來的甲基化狀態(tài)，導(dǎo)致治療失敗。同時(shí)，藥物治療劑量及不良反應(yīng)有待于進(jìn)一步探究。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及研究的不斷深入，以上問題將會(huì)得到解決。

[1] Rodriguez-Paredes M,Esteller M.Cancer epigenetics reaches mainstream oncology[J].Nat Med,2011,17(3):330-339.

[2] Tomita H,Hirata A,Yamada Y,etal.Suppressive effect of global DNA hypomethylation on gastric carcinogenesis[J].Carcinogenesis,2010,31(9):1627-1633.

[3] Ehrlich M,Lacey M.DNA hypomethylation and hemimethylation in cancer[J].Adv Exp Med Biol,2013,754:31-56.

[4] Hu XT,He C.Recent progress in the study of methylated tumor suppressor genes in gastric cancer[J].Chin J Cancer,2013,32(1):31-41.

[5] Lu XX,Yu JL,Ying LS,etal.Stepwise cumulation of RUNX3 methylation mediated by helicobacter pylori infection contributes to gastric carcinoma progression[J].Cancer,2012,118(22):5507-5517.

[6] Arai T,Kasahara I,Sawabe M,etal.Role of methylation of the hMLH1 gene promoter in the development of gastric and colorectal carcinoma in the elderly[J].Geriatr Gerontol Int,2010,10(Suppl 1):S207-S212.

[7] Guan Z,Zhang J,Song S,etal.Promoter methylation and expression of TIMP3 gene in gastric cancer[J].Diagn Pathol,2013,8(1):110.

[8] Bihl MP,Foerster A,Lugli A,etal.Characterization of CDKN2A(p16) methylation and impact in colorectal cancer: systematic analysis using pyrosequencing[J].J Transl Med,2012,10:173.

[9] Kim J,Min SY,Lee HE,etal.Aberrant DNA methylation and tumor suppressive activity of the EBF3 gene in gastric carcinoma[J].Int J Cancer,2012,130(4):817-826.

[10] Yu J,Cheng YY,Tao Q,etal.Methylation of protocadherin 10, a novel tumor suppressor, is associated with poor prognosis in patients with gastric cancer[J].Gastroenterology,2009,136(2):640-651.

[11] Zhong X,Zhu Y,Mao J,etal.Frequent epigenetic silencing of PCDH10 by methylation in human colorectal cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2013,139(3):485-490.

[12] Tang X,Yin X,Xiang T,etal.Protocadherin 10 is frequently downregulated by promoter methylation and functions as a tumor suppressor gene in non-small cell lung cancer[J].Cancer Biomark,2012,12(1):11-19.

[13] Zhao B,Yang P,Yang J,etal.A randomized trial of somatostatin to regulate the VEGFs/VEGFRs in patients with gastric cancer[J].Hepatogastroenterology,2011,58(109):1425-1430.

[14] Shi X,Li X,Chen L,etal.Analysis of somatostatin receptors and somatostatin promoter methylation in human gastric cancer[J].Oncol Lett,2013,6(6):1794-1798.

[15] González CA,Agudo A.Carcinogenesis,prevention and early detection of gastric cancer:where we are and where we should go[J].Int J Cancer,2012,130(4):745-753.

[16] Qu Y,Dang S,Hou P.Gene methylation in gastric cancer[J].Clin Chim Acta,2013,424:53-65.

[17] Abbaszadegan MR,Moaven O,Sima HR,etal.p16 promoter hypermethylation:a useful serum marker for early detection of gastric cancer[J].World J Gastroenterol,2008,14(13):2055-2060.

[18] Sapari NS,Loh M,Vaithilingam A,etal.Clinical potential of DNA methylation in gastric cancer:a meta-analysis[J].PLoS One,2012,7(4):e36275.

[19] Watanabe Y,Kim HS,Castoro RJ,etal.Sensitive and specific detection of early gastric cancer with DNA methylation analysis of gastric washes[J].Gastroenterology,2009,136(7):2149-2158.

[20] Yang J,Wei X,Wu Q,etal.Clinical significance of the expression of DNA methyltransferase proteins in gastric cancer[J].Mol Med Rep,2011,4(6):1139-1143.

[21] Gros C,Fahy J,Halby L,etal.DNA methylation inhibitors in cancer: recent and future approaches[J].Biochimie,2012,94(11):2280-2296.

[22] Piekarz RL,Bates SE.Epigenetic modifiers:basic understanding and clinical development[J].Clin Cancer Res,2009,15(12):3918-3926.

[23] Sugita H,Iida S,Inokuchi M,etal.Methylation of BNIP3 and DAPK indicates lower response to chemotherapy and poor prognosis in gastric cancer[J].Oncol Rep,2011,25(2):513-518.

[24] Ivanova T,Zouridis H,Wu Y,etal.Integrated epigenomics identifies BMP4 as a modulator of cisplatin sensitivity in gastric cancer[J].Gut,2013,62(1):22-33.

[25] Bae JM,Shin SH,Kwon HJ,etal.ALU and LINE-1 hypomethylations in multistep gastric carcinogenesis and their prognostic implications[J].Int J Cancer,2012,131(6):1323-1331.

[26] Shigaki H,Baba Y,Watanabe M,etal.LINE-1 hypomethylation in gastric cancer, detected by bisulfite pyrosequencing, is associated with poor prognosis[J].Gastric Cancer,2013,16(4):480-487.

[27] Lim HK,Park JM,Chi KC,etal.Disappearance of serum methylated p16 indicates longer survival in patients with gastric gancer[J].J Gastric Cancer,2013,13(3):157-163.