車娟娟(綜述),曹邦偉(審校)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京 100050)

肺癌死亡率位居全世界惡性腫瘤的首位，其5年生存率僅為15%。其中，非小細胞肺癌占肺癌的75%。在治療方式上，除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療外，近年來靶向治療的出現(xiàn)在一定程度上為其預(yù)后帶來了新的希望，但是盡管如此，腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍是無法攻克的難題。并且即便早期手術(shù)切除的患者仍會發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，非小細胞肺癌浸潤、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制已成為目前研究的熱點。Claudins蛋白家族是緊密連接(tight junction,TJ) 的主要組成部分，首先在1998年由Furuse等[1]發(fā)現(xiàn)，其參與調(diào)節(jié)細胞的通透性、極性以及細胞的分化和增殖，并且和疾病的免疫防御密切相關(guān)。Claudins蛋白家族表達異常與惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。可能作為NSCLC診斷、治療及預(yù)后判斷的分子標志。

1 Claudins蛋白的分布、結(jié)構(gòu)及功能

Claudins家族包括23個成員，相對分子質(zhì)量約22×103，聚合于細胞質(zhì)膜上構(gòu)成TJ復(fù)合物的主鏈。Claudins蛋白分布于皮膚、腦、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟組織中，其在組織中表達分布具有一定的特異性，大部分組織中表達兩種以上Claudins，如Claudin4和Claudin8存在于腎臟中，而Claudin1、Claudin2及Claudin3共同存在于肝臟中，也有一些組織緊密連接鏈中的Claudins是特定的，少突膠質(zhì)細胞的髓磷脂、睪丸的足突細胞中主要表達的是Claudin11。

Claudins家族成員具有相同的結(jié)構(gòu)，其肽鏈4次穿越細胞膜，N末端和C末端位于細胞內(nèi)部，C末端在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用，其上存在結(jié)合域，可與內(nèi)層的蛋白，如閉鎖小帶1和閉鎖小帶2等分子連接；細胞外的肽鏈形成兩個跨膜環(huán)，這兩個環(huán)可以與鄰近其他細胞的同種類型的環(huán)相接觸，也可以和一些不明確的分子相接觸，通過同源性或異源性接觸調(diào)節(jié)細胞連接處的選擇滲透性。其中Claudins的第一個細胞外環(huán)決定細胞間的跨上皮電荷抵抗和細胞外電荷的選擇性。

2 Claudins蛋白的調(diào)節(jié)途徑

肌動蛋白和肌球蛋白是多種信號分子參與TJ調(diào)節(jié)的兩個共同的作用靶位點：肌球蛋白與肌動蛋白相連并定位于從底部到頂點的連接復(fù)合物，肌球蛋白結(jié)構(gòu)收縮可以對緊密連接膜產(chǎn)生離心性牽引，進而調(diào)節(jié)TJ的滲透性。Claudins對細胞連接處選擇滲透性的調(diào)節(jié)主要通過蛋白激酶途徑實現(xiàn)，蛋白激酶A或蛋白激酶C作用于Claudins上特定氨基酸靶點，一般以絲氨酸、蘇氨酸為主。Claudins磷酸化后，TJ功能下降，表現(xiàn)為氯化物滲透性增加。其可能原因是磷酸化的Claudins干擾TJ的形成[2]。不同蛋白激酶作用于不同的Claudins分子，在研究卵巢癌Claudins的調(diào)節(jié)機制時發(fā)現(xiàn)，當?shù)鞍准っ窤和蛋白激酶C激活后，它們作用在不同的靶蛋白：蛋白激酶A作用于Claudins上C末端第192位氨基酸，而蛋白激酶C使Claudins磷酸化[3]。

3 Claudins組成的TJ結(jié)構(gòu)和功能

Claudins蛋白與咬合蛋白和連接黏附分子等共同組成TJ，其中Claudins蛋白是TJ的主要成分，構(gòu)成了TJ的骨架[4]。TJ又稱閉鎖小帶，是位于細胞側(cè)膜最頂端的一組連續(xù)網(wǎng)結(jié)狀的條索，它與黏附連接和橋粒共同組成了TJ復(fù)合體。TJ通常位于上皮頂端兩相鄰細胞間,在緊密連接處的細胞質(zhì)膜幾乎融合并緊緊結(jié)合在一起。從結(jié)構(gòu)上看,相鄰兩細胞間的TJ是靠緊密蛋白顆粒重復(fù)形成的一排排的條索將兩相鄰細胞連接起來,這些蛋白質(zhì)顆粒的直徑只有幾個納米，它們形成連續(xù)的纖維,就像焊接線一樣，將相鄰細胞間連接起來,并封閉了細胞間的空隙。TJ除了有加強細胞間連接的機械作用外，在控制細胞間離子流和維護組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)上也起重要作用，這就是TJ的屏障功能,如血腦屏障，即腦血管內(nèi)皮細胞的緊密連接形成密集的屏障，以阻止血液與腦細胞外液相混，以及腎小球中參與構(gòu)成血尿屏障等。TJ像柵欄一樣連續(xù)地環(huán)繞細胞頂端，阻止上皮細胞頂側(cè)膜和基底外側(cè)膜中不同分子的相互混雜，這種功能被稱為柵欄功能。若柵欄功能被破壞，將導(dǎo)致細胞極性丟失。此外，TJ在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)上也起了重要作用。

4 Claudins蛋白與非小細胞肺癌

目前關(guān)于Claudins蛋白所構(gòu)成的TJ成為大家關(guān)注的熱點，認為其在腫瘤細胞的浸潤、形態(tài)轉(zhuǎn)化、運輸、最終出現(xiàn)轉(zhuǎn)移等過程中扮演重要的角色。在非小細胞肺癌中也有一些探討機制的研究，而且不同的家族成員作用也不盡相同。

4.1Claudin1與非小細胞肺癌 Claudin1最早是在1998年由Furuse等[1]首先發(fā)現(xiàn)的，因此研究較多。Chao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，64例肺腺癌患者中，Claudin1 mRNA低表達患者總生存期短，通過對另外67例腺癌患者腫瘤標本進行免疫組織化學(xué)檢測，也證實Claudin1 mRNA低表達患者總生存期短。進一步通過時間推移成像證實，Claudin1高表達能夠抑制腫瘤細胞離散，抑制腫瘤細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。在將Claudin1基因剔除后，證實腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。該研究還發(fā)現(xiàn)，Claudin1一方面能夠增加腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移抑制因子的表達，如連接組織生長因子、凝血酶敏感素1、肝癌缺失基因1、咬合蛋白,閉鎖小帶1；另一方面，它能抑制侵襲轉(zhuǎn)移強化因子的表達，如分泌磷酸蛋白1、切像同源盒1、轉(zhuǎn)化生長因子α、胎盤生長因子等。因此，Chao等[5]認為，Claudin1是肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制因子，能夠預(yù)測預(yù)后，并可能成為肺腺癌潛在的治療靶點。Dukes等[6]研究發(fā)現(xiàn)，抑制內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體功能后，TJ蛋白Claudin1堆積在諸如肺、腎等上皮細胞內(nèi)的小囊泡內(nèi)，從而導(dǎo)致上皮細胞極性改變，參與到腫瘤細胞的遷移轉(zhuǎn)移過程中。

Merikallio等[7]則在肺癌細胞系中研究了吸煙對肺腺癌Claudin1表達狀況的影響，發(fā)現(xiàn)吸煙者甚至戒煙者與非吸煙者相比，Claudin1的陽性率明顯增高；在鱗癌患者中，吸煙指數(shù)高者與吸煙較少者及非吸煙者相比，Claudin1的表達明顯增高；該研究顯示，無論是鱗癌還是腺癌患者，Claudin1高表達的患者生存更佳。Jung等[8]研究證實，與腺癌相比，在鱗癌中Claudin1的表達更強，而Claudin4和Claudin5在腺癌的表達更強。鑒于不同Claudins蛋白家族成員在不同病理類型腫瘤存在表達差異，可能會為不同的腫瘤類型尋找作用靶點。

4.2Claudin2與非小細胞肺癌 Claudin2也是學(xué)者關(guān)注的熱點之一，但是其在肺癌腫瘤細胞轉(zhuǎn)移中的作用機制還在研究中。Ikari等[9]采用實時反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)及Western blotting檢測Claudin2蛋白在肺癌細胞系的表達狀況，利用劃痕愈合實驗檢測細胞的遷移能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Claudin2的表達在A549細胞系中高于正常肺組織。Claudin2的剔除并不影響其他連接蛋白的表達，如Claudin1、咬合蛋白及上皮鈣黏素，同時核內(nèi)的c-Fos、c-Jun及核因子κB的表達也未改變，但Sp1在核內(nèi)的表達水平下降，而其剔除后降低細胞遷移能力，伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達降低和酶活性下降，認為Claudin2通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達及酶活性的提高，進而使基質(zhì)金屬蛋白酶9介導(dǎo)的Sp1在核內(nèi)分布提高，最終上調(diào)A529細胞的遷移能力。該研究證實，Claudin2在肺腺癌細胞的遷移中發(fā)揮重要作用，進而影響著腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移進程。

表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)作為目前研究最熱的靶點，也與Claudins蛋白家族存在聯(lián)系。Peter等[10]研究EGFR與Claudin2的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肺A549細胞系擁有功能性的TJ，并且表皮生長因子治療使Claudin2的表達增長了46%；EGFR信號降低了膽堿的單層滲透性，觸發(fā)了細胞的重構(gòu)。該項研究認為，EGFR信號通路在A549細胞生理方面扮演重要角色，并且協(xié)同Claudin2加速腫瘤細胞定植。因此探討表皮生長因子及Claudin2對A549細胞滲透性及重組的影響能夠幫助解釋NSCLC細胞的定植并且有助于研究發(fā)現(xiàn)新的抗腫瘤治療方法。

4.3Claudin3與非小細胞肺癌 Jung等[8]通過免疫組織化學(xué)法回顧性分析14例肺組織及171例非小細胞肺癌標本中Claudin3的表達，發(fā)現(xiàn)正常肺上皮細胞均有表達，而在171例肺癌標本中，45.6%出現(xiàn)表達，其中在鱗癌的表達率為50%，腺癌為41.6%，兩種不同病理類型中表達并無統(tǒng)計學(xué)差異；分析與預(yù)后的關(guān)系，認為Claudin3不能作為預(yù)后分子標志物。而Moldvay等[11]的研究結(jié)果顯示，Claudin3的表達在不同病理類型間明顯不同。在鱗癌和腺癌中表達存在統(tǒng)計學(xué)差異，在腺癌與類癌中表達也存在差異，同時在鱗癌和小細胞癌中也存在表達差異，但是對其預(yù)后的意義尚不明確。

還有研究發(fā)現(xiàn)，Claudin3是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌內(nèi)毒素的天然受體，兩者結(jié)合后能夠?qū)е录毎焖偃芙鈁12]。也有研究顯示，產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌內(nèi)毒素能夠有效地抑制Claudin3表達的惡性腫瘤，由此Claudin3將可能作為腫瘤治療的潛在靶點[13]。

4.4Claudin4與非小細胞肺癌 Lonardi等[14]試圖通過使用Claudin4的特異性抗體在漿膜腔積液中檢測轉(zhuǎn)移腫瘤細胞存在來判斷Claudin4的臨床意義，該研究對345例包括胸膜、腹膜及心包的積液進行染色，結(jié)果顯示230例不同來源的上皮轉(zhuǎn)移患者中，228例抗Claudin4強陽性表達，與此同時，活動期胸膜炎以及惡性胸膜間皮瘤均為陰性表達。另外，該研究還顯示Claudin4能在嚴重炎性反應(yīng)背景下檢測出單個腫瘤細胞的存在。Facchetti等[15]的研究也顯示，在漿膜腔積液中，62例腫瘤轉(zhuǎn)移細胞中60例Claudin4高表達，而在間皮細胞中全部為陰性。鑒于其有高度的敏感性和特異性，Claudin4可能成為鑒別漿膜腔積液轉(zhuǎn)移上皮細胞的理想的單一標志物。

另外，Merikallio等[7]在肺癌細胞系中研究了吸煙對肺腺癌Claudin4表達狀況的影響，發(fā)現(xiàn)吸煙者甚至戒煙者與非吸煙者相比，同Claudin1一致，Claudin4的陽性率也明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在鱗癌患者中，吸煙指數(shù)高者與吸煙較少者及非吸煙者相比，Claudin4的表達也明顯增高。與Claudin1不同之處在于，只有腺癌高表達Claudin4的患者生存更佳，鱗癌則不佳。

4.5Claudin7與非小細胞肺癌 Lu等[16]主要研究Claudin7，發(fā)現(xiàn)其在支氣管上皮細胞正常表達，而在肺癌細胞中下調(diào)或斷裂。為驗證Claudin7的功能，Lu等[16]將Claudin7的cDNA轉(zhuǎn)染至無Claudin7表達的肺癌細胞系NCI-H1299中，發(fā)現(xiàn)該細胞對于肝細胞生長因子的治療應(yīng)答降低，表現(xiàn)為能動性下降，且比正常細胞形成的足突明顯減少。另外，此類細胞在肝細胞生長因子治療后侵襲能力急劇降低。該研究還證實，與對照組細胞相比，轉(zhuǎn)染Claudin7的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2磷酸化水平顯著降低，提示Claudin7抑制侵襲功能可能是通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路實現(xiàn)的，之后的實驗也證明了這一點。

關(guān)于表達，Li等[17]的研究證實，Claudin7在肺鱗癌及腺癌組織中明顯下降，而且其表達水平與腫瘤的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。Merikallio等[7]在肺癌細胞系中也研究了吸煙對肺腺癌Claudin7表達狀況的影響，在鱗癌患者中，吸煙指數(shù)高者與吸煙較少者及非吸煙者相比，Claudin7的表達顯著增高，而且高表達Claudin7的鱗癌患者生存更佳。

4.6Claudin18與非小細胞肺癌 Niimi等[18]首先證實，Claudin18可能在肺及胃腸的細胞TJ中發(fā)揮重要作用。Merikallio等[19]分析Claudin18與Claudin10在原發(fā)性肺癌的表達，結(jié)果顯示12.7%(34/268)的患者表達Claudin18，而Claudin10的表達則為12.5%(34/271)，且兩者的表達明顯相關(guān)；兩者的表達主要存在于肺腺癌，陽性率分別為21.2%(23/108)和23.4%(26/111)，女性患者兩者多高表達，有趣的是，兩者的表達更多見于非吸煙者；進行預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，在腺癌中Claudin18高表達提示預(yù)后獲益，是獨立的預(yù)后因素，可能成為肺腺癌的預(yù)后標志物。另外也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Claudin18可能也參與肺轉(zhuǎn)移的過程[20]。甚至有研究證實，Claudin18可能作為肺小細胞肺癌治療的靶點[21]。

5 結(jié) 語

由于Claudins蛋白家族在腫瘤中的特異性表達，使其可能成為不同腫瘤(包括肺癌)的分子標志物，用于不同病理類型腫瘤的鑒別；另外，個別成員也可能成為預(yù)測肺癌預(yù)后的標志物。從功能上來講，Claudins蛋白家族多個成員參與了肺癌的轉(zhuǎn)移，涉及不同的信號通路，這可能為將來肺癌的靶向治療提供更多的靶點。相信Claudins蛋白家族能夠在肺癌的檢測、預(yù)后判斷甚至靶向治療方面發(fā)揮積極的作用。

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