劉以俊，周婧倩，王慧瑩，金盧陽(yáng)，孫 婧(綜述)，何穎芝，李玉華※(審校)

(1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510282； 2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科，廣州 510282)

隨著化療方案的改進(jìn)和造血干細(xì)胞移植的進(jìn)展，急性白血病(acute leukemia,AL)的完全緩解率得到明顯提高，然而仍有許多獲得完全緩解的患者在數(shù)年內(nèi)復(fù)發(fā)。5年總體生存率僅為40%～50%[1]。白血病微小殘留病(minimal residual disease,MRD)是復(fù)發(fā)的主要原因。監(jiān)測(cè)MRD為預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的重要途徑。目前監(jiān)測(cè)MRD的方法主要有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、熒光原位雜交、流式細(xì)胞技術(shù)和定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)。定量PCR目前應(yīng)用較為廣泛。其靶基因有融合基因、突變基因和異常表達(dá)基因。隨著臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的進(jìn)展，不斷有新的異常表達(dá)基因被發(fā)現(xiàn)，如表皮生長(zhǎng)因子受體通路底物8(epidermal growth factor receptor pathway substrate 8，Eps8)，熱門的異常表達(dá)基因，如WT1(Wilms′s tumor-1 gene)又有許多新進(jìn)展。該文所選取的WT1、尾型同源盒基因(caudal-type homeoboxgene,CDX)2和Eps8基因均可能有提示預(yù)后和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)的作用。

1 WT1基因

1.1WT1基因的結(jié)構(gòu)與功能 WT1基因是從腎胚胎腫瘤中分離得到的抑癌基因，位于染色體11p13上。WT1蛋白有4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，分別是Cys2-His2。同時(shí)，還含有富含脯氨酸(Pro)和谷氨酸酰胺(Gln)的區(qū)域，主要用于調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[2]。WT1基因主要表達(dá)于胚胎期，并且對(duì)泌尿系統(tǒng)的發(fā)育起重要作用。成年以后，WT1基因僅少量表達(dá)于腎臟、口腔、子宮內(nèi)膜、睪丸、脾臟和正常造血干細(xì)胞[3]。

1.2WT1基因的臨床意義

1.2.1WT1基因的表達(dá)變化 WT1基因在骨髓細(xì)胞中極少量表達(dá)，在外周血細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。大多數(shù)AL細(xì)胞中有WT1基因的高表達(dá)。但是，在WT1基因的表達(dá)與白血病診斷的亞型是否有關(guān)仍存在爭(zhēng)議。Schmid等[4]通過(guò)RT-PCR對(duì)125例急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)患者的骨髓標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，WT1基因在73%的患者中高表達(dá)。但是，診斷時(shí)的WT1基因高表達(dá)與患者的年齡、FAB(French-American-British)分型和染色體組形態(tài)等因素?zé)o關(guān)。Shimada等[5]對(duì)158例兒童AML患者進(jìn)行了WT1 mRNA的定量分析顯示，初診的骨髓標(biāo)本77.8%為WT1陽(yáng)性，其中存在inv(16),t(15;17)和唐氏綜合征時(shí)WT1基因高表達(dá)，存在11q23染色體畸形時(shí)WT1基因低表達(dá)。

1.2.2WT1基因與AL的預(yù)后 盡管WT1基因在AL患者中高表達(dá)得到了專家的認(rèn)可，但對(duì)其與AL預(yù)后的關(guān)系仍有爭(zhēng)議[4-5]。Polak等[6]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了51例AML患者的外周血標(biāo)本，結(jié)果顯示，異基因造血干細(xì)胞移植前WT1基因高表達(dá)的患者預(yù)后更差，且檢測(cè)外周血WT1含量有助于監(jiān)測(cè)MRD。Pozzi等[7]研究122例AML患者發(fā)現(xiàn)，67例(55%)患者有WT1基因的高表達(dá)，即高于100拷貝，并且WT1高表達(dá)較WT1低表達(dá)患者的復(fù)發(fā)率更高，5年生存率更低。Pozzi等[7]對(duì)17例WT1表達(dá)過(guò)高的患者進(jìn)行了供者淋巴細(xì)胞輸注，這些患者的生存率為44%，而沒(méi)有接受該治療的21例WT1高表達(dá)患者的生存率僅為14%。據(jù)此，研究者認(rèn)為WT1可用于提示AL患者的預(yù)后。Andersson等[8]發(fā)現(xiàn)，骨髓標(biāo)本或外周血標(biāo)本的WT1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在1個(gè)月內(nèi)降低一個(gè)數(shù)量級(jí)以上的患者，其復(fù)發(fā)率較低，生存率較高，因此研究者認(rèn)為WT1基因有望成為成人AML的MRD監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)。

也有專家質(zhì)疑WT1基因?qū)Π籽☆A(yù)后的提示作用。Schmid等[4]通過(guò)RT-PCR的方法分析了125例AML的初診患者，結(jié)果顯示，WT1基因不能預(yù)測(cè)完全緩解率、緩解持續(xù)時(shí)間和生存率，認(rèn)為其治療方案的不統(tǒng)一可能是導(dǎo)致陰性結(jié)果的原因之一。同時(shí)指出WT1基因?qū)τ贛RD的預(yù)測(cè)作用還有待進(jìn)一步研究。有報(bào)道稱，WT1基因在診斷時(shí)沒(méi)有提示預(yù)后的價(jià)值，但在化療結(jié)束后的M1亞型或有FLT3-ITD(FLT3-internal tandem duplication,FLT3-ITD)基因突變的AML中有此作用[5]。

對(duì)于WT1基因能否作為監(jiān)測(cè)MRD的靶點(diǎn)，人們一直存在爭(zhēng)論。有部分學(xué)者認(rèn)同這一觀點(diǎn)[6,8-9]。Polák等[10]通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了51例AML患者外周血的WT1基因，同時(shí)還用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞技術(shù)和檢測(cè)融合基因等方式監(jiān)測(cè)MRD，結(jié)果表明，檢測(cè)外周血WT1含量有助于監(jiān)測(cè)MRD，并且7例患者的WT1基因比其他監(jiān)測(cè)MRD的方法更加敏感。Polák 等[10]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)151例AML患者后得出了相同的結(jié)論，同時(shí)還確定出AML緩解的WT1基因上限為0.02 WT1/ABL。據(jù)此上限，可以預(yù)測(cè)或早期診斷AML的復(fù)發(fā)。但是，也有研究結(jié)果與此相反[11-12]。Elmaagacli等[11]用PCR分析了46例AL的患者，認(rèn)為WT1不能作為異基因造血干細(xì)胞移植后監(jiān)測(cè)MRD的靶點(diǎn)，MRD只能用于預(yù)測(cè)有t(15；17)異位的AML患者。Luna等[12]用高分辨溶解和熒光能量共振轉(zhuǎn)移雜交探針來(lái)檢測(cè)175例成年AML患者的WT1基因單核苷酸多態(tài)性rs16754，得出WT1同樣不能作為MRD靶點(diǎn)的結(jié)論。

2 CDX2基因

2.1CDX2基因、蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 編碼同源盒轉(zhuǎn)錄因子，可分為GSH(Glutathione Synthetase)2、CDX1、CDX2、CDX3和CDX4基因，有調(diào)節(jié)胚胎造血的功能[14]。CDX2基因位于人類染色體的13q12～12區(qū)，包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，CDX2蛋白對(duì)胚胎發(fā)育和成人腸上皮細(xì)胞的增殖和分化起著重要作用[15]。研究顯示，鼠骨髓祖細(xì)胞中CDX2的高表達(dá)會(huì)干擾淋巴細(xì)胞的生成[16]。同時(shí)，急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lmphocytic leukemia,ALL)白血病細(xì)胞中CDX2的減少會(huì)抑制ALL前B細(xì)胞株Nalm-6集落的形成。

2.2CDX2基因的臨床意義

2.2.1CDX2基因與白血病發(fā)病 有t(12;13)(p13;q12)的AML同時(shí)表達(dá)了CDX2 基因和融合基因ETV6(ets variant 6)-CDX2。Rawat等[17]發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)移植含有CDX2基因的白血病細(xì)胞后才能使小鼠患病。由此推測(cè)，異位表達(dá)的CDX2基因是導(dǎo)致AML的重要因素。有報(bào)道顯示，阻斷CDX2蛋白的N端可擾亂同源異型基因(homeotic genes,Hox)的表達(dá)，從而誘發(fā)白血病。針對(duì)151例AML患者的研究得出，環(huán)加氧酶的含量和Hox有相關(guān)性[18]。有報(bào)道顯示，CDX2基因在90%的AML患者中高表達(dá)，但在正常人的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞中低表達(dá)[15,18]。

2.2.2CDX2基因與白血病預(yù)后 Thoene等[16]發(fā)現(xiàn)，ALL中有CDX2的高表達(dá)，以ph(+)ALL、B-ALL和前T-ALL最明顯。CDX2水平與生存率呈負(fù)相關(guān)，并且CDX2的高表達(dá)可以作為ALL的一個(gè)危險(xiǎn)因素。Lu等[18]用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了108例AML患者和7名志愿者的CDX2基因表達(dá)情況，認(rèn)為CDX2的高表達(dá)預(yù)示較低的完全緩解率。

Riedt等[19]用流式細(xì)胞技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了37例兒童ALL患者的CDX2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并將其與常規(guī)方法得出的MRD結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CDX2/膽色素原脫氨酶>4%的患者更容易在開(kāi)始化療33 d和完全緩解2周后出現(xiàn)MRD陽(yáng)性。

3 Eps8基因

3.1Eps8基因、蛋白的結(jié)構(gòu)與功能 Eps8基因全長(zhǎng)169 436 bp，mRNA長(zhǎng)為4088 bp，定位于人類染色體12p12.3。Eps8蛋白是表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的底物之一，為一種相對(duì)分子質(zhì)量為(68～97)×103的酪氨酸激酶。Eps8蛋白在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、有絲分裂和骨架形成中起重要作用[19-20]。Eps8蛋白可分為三個(gè)區(qū)域，N末端的磷酸化酪氨酸結(jié)合區(qū)，中心的SH3(Src Homology 3 domain)區(qū)域，C末端的效應(yīng)區(qū)域。SH3區(qū)域有連接的作用，有助于形成Eps8-Abil(E3bl)-Sos1復(fù)合物。C末端效應(yīng)器可以激活Sos1(Ras和Rac蛋白的雙重鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子)[22]。

3.2Eps8基因的臨床意義

3.2.1Eps8基因在惡性腫瘤中的表達(dá)變化 在多個(gè)研究中，Eps8基因被證明在垂體瘤、子宮頸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌和乳腺癌等實(shí)體瘤中高表達(dá)，而且Eps8多與癌細(xì)胞的增殖、入侵和轉(zhuǎn)移有關(guān)，有望成為白血病的治療靶點(diǎn)和監(jiān)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)[23-28]。最近研究顯示，血液學(xué)惡性腫瘤中也有Eps8基因的異常表達(dá)。熊文艷等[28]用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western-blot分析了KGla(人髓系白血病細(xì)胞株)、HL-60(人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、K562(人慢性髓系白血病、紅白血病變細(xì)胞株)、ARH-77(多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株)、RPMI-8226(人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株)和Raji(人Burkitt′s淋巴瘤細(xì)胞株)的mRNA和蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示，上述細(xì)胞株中只有ARH-77有Eps8 mRNA的高表達(dá)，只有ARH-77和KG1a有Eps8蛋白的高表達(dá)。

3.2.2Eps8基因與白血病預(yù)后 在宮頸癌、甲狀腺癌和乳腺癌等實(shí)體瘤中，Eps8基因高表達(dá)預(yù)示腫瘤耐藥和預(yù)后不良[27-29]。在惡性血液腫瘤中，Eps8也有可能成為監(jiān)測(cè)預(yù)后的新靶點(diǎn)。Kang等[30]對(duì)97例兒童ALL患者的外周血和骨髓白細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)譜的分析，統(tǒng)計(jì)分析顯示，除了年齡因素，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3、易洛魁族同源盒2和轉(zhuǎn)化酸性卷曲含蛋白2對(duì)無(wú)事件生存率的影響較大，這三種基因與Eps8有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶3低表達(dá)的一組中預(yù)后良好，而余下的兒童按表達(dá)率不同的易洛魁族同源盒2和轉(zhuǎn)化酸性卷含蛋白2分成了兩組，兩組間的生存率有明顯差異，在此分類中，易洛魁族同源盒2、Eps8及三唑磷水解酶基因52表達(dá)提示兒童ALL預(yù)后不良。南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院血液科實(shí)驗(yàn)室正在研究Eps8在白血病中的MRD監(jiān)測(cè)作用以及進(jìn)行相關(guān)疫苗的研發(fā)。

4 小 結(jié)

目前，AL的完全緩解率已經(jīng)有較大提高，但復(fù)發(fā)仍是影響患者長(zhǎng)期生存率的主要因素，因此監(jiān)測(cè)MRD有重大意義。隨著對(duì)WT1、CDX2和Eps8基因研究的不斷深入，它們對(duì)惡性血液腫瘤預(yù)后的提示作用逐漸得到學(xué)者的認(rèn)可，同時(shí)也有越來(lái)越多的學(xué)者探尋其對(duì)MRD的監(jiān)測(cè)意義，但仍缺乏大樣本的隨機(jī)對(duì)照臨床研究。目前臨床采用的融合基因和突變基因的表達(dá)率和代表性都難以滿足需求。該文所述的基因有可能成為更加實(shí)時(shí)準(zhǔn)確的MRD監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)。

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