蔡孟華，李 錚，董 鵬，吳瑞平，何 維*

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所免疫學(xué)系;2.病原生物學(xué)研究所，北京 100005）

高致病性禽流感病毒H5N1，屬于甲型流感病毒，主要在禽類之間傳播導(dǎo)致數(shù)以百計(jì)的家禽死亡。自1997年香港首次報(bào)道人感染H5N1病例以來，迄今為止全球累計(jì)感染641人，死亡380人，其中中國感染45人，死亡30人，感染致死率66.7%。禽流感病毒的傳播已突破物種間屏障，獲得了直接感染人的能力，雖然沒有確鑿的證據(jù)證明禽流感病毒可以在人群之間直接相互傳播［1］，然而已證明經(jīng)過多次傳代或者點(diǎn)突變的禽流感病毒能夠在哺乳動(dòng)物雪貂之間進(jìn)行直接相互傳播［2－3］。H5N1病毒借助表面的HA與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合感染宿主細(xì)胞，同時(shí)HA也是宿主產(chǎn)生中和抗體的重要抗原。本研究擬通過表達(dá)串聯(lián)抗原表位的病毒樣顆粒為免疫原制備單抗，分析鑒定中和表位，為研制表位肽疫苗及抗體治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Sf9細(xì)胞、MDCK細(xì)胞和HEK293T細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒 HA-pcDNA3.1、NA-pcDNA3.1和PNL4-3為實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清（Gibco公司）;轉(zhuǎn)染試劑lipofect2000（Invitrogen公司）;細(xì)胞裂解液及熒光素酶底物（Promega公司）;牛血清白蛋白BSA、小鼠抗體亞型檢測(cè)試劑盒（Sigma公司）;Protein G HP親和柱（GE Healthcare公司）;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（Pierce公司）;抗His單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（中杉金橋生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 抗HA表位肽抗體制備:選取9條候選表位［4］相應(yīng)位點(diǎn)的10肽片段序列（表1），設(shè)計(jì)成4條串聯(lián)表位序列（表2）。由艾比瑪特生物醫(yī)藥公司制備單克隆抗體，共獲得23株單克隆抗體腹水。

1.2.2 抗體純化鑒定:將腹水高速離心15 min，取上清0.45 μm濾膜過濾備用。以20～30個(gè)柱床體積的PBS平衡Protein G柱，將經(jīng)過濾的腹水上清反復(fù)上樣，加入甘氨酸（pH 2.7）緩沖液洗脫，在預(yù)先加入Tris-HCl（pH 9.0）的微量管中收集洗脫液，－20℃保存，備用。

1.2.3 抗體亞型鑒定:稀釋抗體至1 mg/L包被96孔板，37℃孵育1 h，PBST洗滌后加入山羊抗鼠免疫球蛋白不同亞型的抗體反應(yīng)30 min，洗滌3次，加入HRP標(biāo)記兔抗羊IgG反應(yīng)30 min。顯色終止，酶標(biāo)儀測(cè)定。

表1 合成多肽信息表Table 1 Information of synthetic peptides

表2 設(shè)計(jì)串聯(lián)表位肽信息表Table 2 Information of tandem epitope peptides

1.2.4 假病毒微量中和實(shí)驗(yàn):包裝5株H5N1假病毒，分別為青海（禽）株A/Bar-headed Goose/Qinghai/1/05 H5N1、新疆（人）株 A/Xinjiang/01/06 H5N1、越南（人）株A/Viet Nam/1203/04、新西伯利亞（禽）株A/duck/Novosibirsk/56/05和印度尼西亞（人）株A/Indonesia/5/05，其中 QH H5N1、XJ H5N1 和 NV H5N1屬于clade 2.2，IN H5N1屬于clade 2.3.1，VN H5N1屬于clade 1，這些毒株涵蓋了中國境內(nèi)流行的H5N1病毒主要分枝。包裝步驟:提取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（HA-pcDNA3.1，NA-pcDNA3.1，PNL4-3），以 HA∶NA∶PNL4-3=1∶1∶2 的比例轉(zhuǎn)染 HEK293T 細(xì)胞，48 h收集上清并過濾。測(cè)定病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50），以100×TCID50/孔作為感染劑量，病毒稀釋液依次稀釋抗體，混合病毒和抗體室溫放置30 min加入犬腎細(xì)胞。48 h棄細(xì)胞上清并洗滌，加入30 μL細(xì)胞裂解液，室溫裂解30 min，加入50 μL熒光素酶底物檢測(cè)發(fā)光值，即相對(duì)發(fā)光單位（relative luminescence units，RLU），重復(fù)3 次平行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算公式1－（實(shí)驗(yàn)孔R(shí)LU均值－細(xì)胞對(duì)照RLU均值）/（病毒對(duì)照RLU均值－細(xì)胞對(duì)照RLU均值），即所測(cè)樣品的抑制率百分?jǐn)?shù)，根據(jù)抑制率百分?jǐn)?shù)擬合曲線計(jì)算IC50，以表示抗體的中和活性。

1.2.5 抗體與合成肽的結(jié)合實(shí)驗(yàn):合成9條10個(gè)氨基酸多肽，經(jīng)HPLC分析純度均大于90%（表1）。將不同合成肽包被96孔板（5 mg/L），室溫封閉2 h加入倍比稀釋的待鑒定抗體，孵育1 h，洗滌3次與HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG反應(yīng)1 h后顯色終止，酶標(biāo)儀測(cè)定。平行重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 抗體與rHA的結(jié)合實(shí)驗(yàn):采用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)4種含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的HA（His-HA），分別命名為 XJ-rHA、QH-rHA、HK-rHA和AH-rHA。Western blot檢測(cè)單抗與上述rHA的結(jié)合。rHA經(jīng)12%SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將稀釋的待鑒定抗體與剪切膜室溫孵育1 h，洗膜3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG室溫作用1 h，重復(fù)洗滌滴加底物，化學(xué)發(fā)光成像鑒定。

2 結(jié)果

2.1 親和層析純化腹水檢測(cè)抗體亞型

亞型結(jié)果顯示10株為IgG型，其中絕大多數(shù)為IgG1和IgG3亞型，部分為IgG2a和IgG2b亞型（表3）。10%SDS-PAGE鑒定，純化后的10株IgG型單抗都具有55 ku和25 ku兩條蛋白染色帶（圖1）。

2.2 假病毒微量中和實(shí)驗(yàn)

10株單抗以高中低3個(gè)劑量濃度對(duì)QH H5N1假病毒進(jìn)行中和活性篩選（圖2）。

具有中和活性者被進(jìn)一步稀釋測(cè)定。其中2株單抗具有對(duì)QH、XJ、VN和NV H5N1高效中和活性，1株單抗對(duì)QH、XJ有中和活性。在所用的抗體濃度下，3株抗體對(duì)IN H5N1無中和作用（圖3，表4）。

表3 單克隆抗體的亞型鑒定Table 3 Isotype of mAbs

圖1 純化后的抗表位肽單抗的SDS-PAGE圖Fig 1 10%SDS-PAGE for purified mAbs against antigenic epitopes

圖2 單克隆抗體對(duì)QH H5N1假病毒中和活性的篩選Fig 2 Screen neutralizing antibodies against QH H5N1 pseudotypes

圖3 單克隆抗體對(duì)QH、XJ假病毒中和活性Fig 3 Neutralization by antibodies against QH/XJ H5N1 pseudotypes

表4 單克隆抗體對(duì)H5N1假病毒半數(shù)抑制濃度Table 4 IC50s of antibodies 22L1，17D2 and 6A2 against a panel of H5N1-pseudotypes

2.3 中和抗體與表位肽的結(jié)合實(shí)驗(yàn)

3株中和抗體，其中Mab 6A2和17D2可與Pc劑量依賴性特異性結(jié)合，Mab 22L1能識(shí)別一個(gè)氨基酸差異的Pa與Pb，其結(jié)合具有抗體劑量依賴性（圖4）。提示Pa、Pb和Pc可能是產(chǎn)生中和抗體的優(yōu)勢(shì)表位。

圖4 單抗對(duì)表位肽的劑量依賴結(jié)合實(shí)驗(yàn)Fig 4 Dose dependent of binding of mAbs against epitopes

2.4 免疫印跡鑒定中和抗體對(duì)4種HA蛋白的結(jié)合

與陽性抗his抗體比較，3株中和活性抗體均能結(jié)合4種rHA，在70 ku有特異性雜交條帶（圖5）。同時(shí)采用HEK293T細(xì)胞和Sf9昆蟲細(xì)胞的全細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照，沒有雜到任何條帶（結(jié)果未列出）。

圖5 中和活性單抗的Western blot檢測(cè)Fig 5 Western blot for neutralizing monoclonal antibodies

3 討論

高致病性禽流感H5N1病毒血凝素蛋白HA是病毒結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體，介導(dǎo)病毒入胞的關(guān)鍵分子，也是中和抗體及疫苗研制的主要靶標(biāo)分子。HA蛋白由HA1和HA2兩個(gè)亞單位通過富含堿性氨基酸的裂解區(qū)域連接，羧基末端疏水區(qū)（HA1）插入病毒囊膜的雙層脂質(zhì)膜中，是HA與受體分子的結(jié)合部位，氨基末端疏水區(qū)（HA2），具有膜融合活性，是病毒侵入宿主細(xì)胞必須部分［5－6］。在抵御病毒感染過程中，中和抗體能有效地保護(hù)機(jī)體清除病毒。本研究所獲得的中和抗原表位“LIKKNNAYPT”和“R/KSSFFRNVVW”所在區(qū)域與利用合成肽阻斷HA蛋白與單抗結(jié)合鑒定單抗結(jié)合區(qū)域篩選抗原表位相吻合［7］。

利用串聯(lián)表位肽制備鑒定單克隆抗體，獲得具有中和活性的單抗及其特異識(shí)別的表位。3株具有高效活性的中和抗體能夠特異識(shí)別HA1 143～163位點(diǎn)的多肽。所獲中和抗體能夠與高溫變性的4種rHA蛋白結(jié)合，但不能與直接包被的rHA蛋白結(jié)合，提示上述單抗傾向于識(shí)別線性表位。今后可對(duì)其進(jìn)行人源化改造，為抗體治療奠定基礎(chǔ)。

由于HA基因抗原漂移以及與人類抗體識(shí)別譜相似的類人類抗體環(huán)境導(dǎo)致禽流感病毒不斷變異，突破物種間屏障獲得直接感染人的能力，目前預(yù)防人感染禽流感最行之有效的的方法仍然是疫苗免疫。傳統(tǒng)的流感疫苗使用的基因型根據(jù)WHO每年提供的毒株類型確定，這些疫苗在亞洲的保護(hù)效果并不令人滿意［8－9］。本研究致力于分析中國境內(nèi)流行病毒株，所獲得的候選表位為針對(duì)中國地區(qū)流行株新型疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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