周念波

（武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北武漢430415）

普魯蘭酶的分離純化及部分酶學(xué)性質(zhì)

周念波*

（武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北武漢430415）

對(duì)鹽球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）所產(chǎn)的普魯蘭酶粗酶液的耐熱耐酸性進(jìn)行了比較研究，并采用（NH4）2SO4鹽析、透析、DEAE-Sephadex A25陰離子交換、Sephadex G-100凝膠過(guò)濾對(duì)Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶進(jìn)行分離純化，并測(cè)定了其部分酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶在低于65℃和pH4.0～7.5范圍內(nèi)有很好的穩(wěn)定性，最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH為5.0～5.4，相對(duì)分子質(zhì)量為8.17×104，Km值為0.24 mg/mL。

普魯蘭酶；純化；性質(zhì)

普魯蘭酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是能夠?qū)Ｒ恍缘刈饔糜谄蒸斕m糖、支鏈淀粉、糖原及相應(yīng)低聚糖中的α-1，6-糖苷鍵，從而切下整個(gè)側(cè)枝的一種脫支酶，已廣泛應(yīng)用于以淀粉為原料的各種工業(yè)生產(chǎn)中。

文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的普魯蘭酶有多種，在應(yīng)用方面近年來(lái)主要以開(kāi)發(fā)耐熱耐酸普魯蘭酶為主。本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室篩選所得的鹽球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的發(fā)酵粗酶液為研究對(duì)象，探討其在熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性方面的性質(zhì)，對(duì)其中符合耐熱耐酸特性的普魯蘭酶，進(jìn)一步進(jìn)行分離純化和其他方面酶學(xué)性質(zhì)的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑

普魯蘭糖，純度99%，上海普奧生物科技有限公司；DEAE-Sephadex A25，上?？笊锛夹g(shù)有限公司；Sephadex G-100，南京都萊生物技術(shù)有限公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，相對(duì)分子量1.44×104～9.74×104，大連寶生物工程有限公司。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

鹽球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），武漢生物工程學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室自篩。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：每100 g培養(yǎng)基中添加糯米淀粉2.5 g，蛋白胨1 g，（NH4）2SO40.25 g，MgSO4· 7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO40.001 g，KH2PO40.1 g，pH5.0。

搖瓶產(chǎn)酶條件：35℃，160 r/min，搖瓶培養(yǎng)48 h。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

搖瓶培養(yǎng)后，收集發(fā)酵液，5 000 r/min低溫離心后取上清液，制得粗酶液。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

蛋白質(zhì)濃度測(cè)定采用Folin-酚試劑法（Lowry法）。

1.3.3 酶活測(cè)定

酶活測(cè)定參照參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 硫酸銨分級(jí)沉淀

向粗酶液中緩慢加入（NH4）2SO4至25%飽和度，4℃靜置過(guò)夜后7 500 r/min冷凍離心，棄去沉淀。在清液中繼續(xù)加入（NH4）2SO4，使其飽和度達(dá)到75%，4℃靜置過(guò)夜后7 500 r/min冷凍離心，將沉淀溶于0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液，置于透析袋中，用0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液透析24 h。

1.3.5 DEAE-SephadexA25離子交換層析

將透析后的酶液上樣至已平衡好的層析柱（2 cm×15 cm），用0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液（內(nèi)含0.0 mol/L～0.5 mol/L的NaCl）進(jìn)行梯度洗脫，控制流速為0.5 mL/min，每管5.0 mL收集，測(cè)定酶活，合并酶活較高的部分，用PEG20000進(jìn)行濃縮。

1.3.6 SephadexG-100凝膠過(guò)濾層析

上步濃縮后的酶液上樣至已用0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液平衡的層析柱（1.5 cm×50 cm），用相同緩沖液進(jìn)行洗脫，控制流速為0.2 mL/min，每3.0 mL收集一管，測(cè)定各管酶活，合并酶活較高的部分，用PEG20000進(jìn)行濃縮。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用不連續(xù)垂直平板電泳系統(tǒng)，對(duì)純化后的普魯蘭酶進(jìn)行SDS-PAGE純度分析。濃縮膠和分離膠質(zhì)量濃度分別為3%和15%，考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)普魯蘭酶活性及穩(wěn)定性的影響

分別于不同溫度下測(cè)定普魯蘭酶活力，以活力最高者為100%對(duì)照，試驗(yàn)溫度對(duì)3種菌株所產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)酶在低于60℃范圍內(nèi)，酶活隨溫度升高而升高，當(dāng)溫度超過(guò)60℃后，酶活逐漸下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產(chǎn)酶在60℃～70℃范圍內(nèi)酶活較高，65℃時(shí)酶活最高；菌株Bacillus subtilis所產(chǎn)酶在50℃時(shí)酶活最高。因此菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產(chǎn)普魯蘭酶的最適作用溫度分別為60℃、65℃和50℃。

圖1 溫度對(duì)普魯蘭酶活力的影響

將普魯蘭酶液分別在不同溫度下保溫60 min后，再按1.3.3的方法測(cè)定殘余酶活，以活力最高者為100%對(duì)照，試驗(yàn)溫度對(duì)3種菌株所產(chǎn)普魯蘭酶穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶在低于65℃時(shí)穩(wěn)定性較好，殘余活力在76%以上，溫度高于65℃后，酶活開(kāi)始迅速下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產(chǎn)酶熱穩(wěn)定性范圍為低于70℃，殘余活力在80%以上；而菌株Bacillus subtilis所產(chǎn)酶的熱穩(wěn)定性較前兩者稍差，殘余活力在80%以上的溫度范圍為低于55℃。

圖2 溫度對(duì)普魯蘭酶穩(wěn)定性的影響

2.2 pH對(duì)普魯蘭酶活性及穩(wěn)定性的影響

分別于不同的pH值下測(cè)定普魯蘭酶活力，以活力最高者為100%對(duì)照，試驗(yàn)pH對(duì)3種菌株所產(chǎn)普魯蘭酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，pH對(duì)3種菌株所產(chǎn)酶的活性均有較大的影響。菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶在pH5.0～5.4范圍內(nèi)對(duì)底物普魯蘭糖分解能力最強(qiáng)，酶活性最高；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產(chǎn)酶在pH7.0～8.0范圍內(nèi)對(duì)底物的分解能力最強(qiáng)，而菌株Bacillus subtilis在pH5.4時(shí)酶活性最高。因此，菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產(chǎn)普魯蘭酶的最適作用pH分別為5.0～5.4、7.0～8.0和5.4。

圖3 pH對(duì)普魯蘭酶活力的影響

將普魯蘭酶液在不同pH值緩沖液中于室溫保持24 h后，再按1.3.3的方法測(cè)定殘余酶活，以活力最高者為100%對(duì)照，試驗(yàn)pH對(duì)3種菌株所產(chǎn)普魯蘭酶穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶在pH4.0～7.5范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，殘余酶活力在88%以上，超出此pH范圍后酶的穩(wěn)定性下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產(chǎn)酶在pH6.0～8.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，殘余活力在90%以上；而菌株Bacillus subtilis所產(chǎn)酶的較高穩(wěn)定性表現(xiàn)在pH4.4～7.5范圍內(nèi)，殘余酶活力在86%以上。

圖4 pH對(duì)普魯蘭酶穩(wěn)定性的影響

2.3 耐熱耐酸普魯蘭酶的確定

菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產(chǎn)普魯蘭酶的最適作用溫度、最適作用pH及熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性范圍見(jiàn)表1。

表1 3種菌株所產(chǎn)普魯蘭酶的最適作用溫度、pH及穩(wěn)定性范圍

從表1可以看出，菌株Halococcus sp.Z1和Bacillus amyloliquefaciens所產(chǎn)普魯蘭酶具有較高的最適作用溫度和熱穩(wěn)定性，符合耐熱的特性；菌株Halococcus sp.Z1和Bacillus subtilis所產(chǎn)普魯蘭酶的最適作用pH在pH5.0～5.4和pH5.4，酸堿穩(wěn)定性分別在pH4.0～7.5和pH4.4～7.5范圍內(nèi)，具有耐酸的特性。綜合考慮，菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶既具有耐熱又具有耐酸的特性，因此以菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶作為后續(xù)試驗(yàn)樣品。

2.4 普魯蘭酶的純化

普魯蘭酶經(jīng)鹽析、透析、離子交換和凝膠過(guò)濾后，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)純化后，普魯蘭酶的純化倍數(shù)為10.78倍，酶活力回收率為26.91%。DEAESephadex A25離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析的洗脫曲線分別見(jiàn)圖5和圖6。

2.5 普魯蘭酶純度鑒定和分子量測(cè)定

將純化后的普魯蘭酶及標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)果見(jiàn)圖7。純化后的普魯蘭酶經(jīng)SDS-PAGE后只有一條蛋白質(zhì)譜帶，說(shuō)明該酶達(dá)到了均一的程度。測(cè)得該普魯蘭酶的相對(duì)分子質(zhì)量約為81 700。

表2 普魯蘭酶的純化結(jié)果

圖5 普魯蘭酶的DEAE-Sephadex A25柱洗脫曲線

圖6 普魯蘭酶的Sephadex G-100柱洗脫曲線

圖7 普魯蘭酶的SDS-PAGE圖

2.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)

將普魯蘭酶與不同質(zhì)量濃度的普魯蘭糖溶液保溫反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)速度，以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)（1/V），普魯蘭糖質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/［S］）為橫坐標(biāo)作Lineweaver-Burk圖，結(jié)果如圖8所示，從而得出普魯蘭酶米氏常數(shù)Km為0.24 mg/mL，Vm值為10.11 μmol/（min·mL）。

圖8 普魯蘭酶Lineweaver-Burk圖

3 結(jié)論

對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選得到的具有較高酶活的菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了簡(jiǎn)單的初探，研究表明Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶最適反應(yīng)溫度為60℃，在低于65℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH為5.0～5.4，在pH4.0～7.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定。相對(duì)菌株Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產(chǎn)酶而言，菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶具有耐熱耐酸性質(zhì)，較適合于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

對(duì)菌株Halococcus sp.Z1所產(chǎn)普魯蘭酶進(jìn)行了分離純化，測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量為81 700，Km值為0.24 mg/mL。

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Purification and properties ofpullulanase

ZHOUNian-bo*
（Department ofbioengineering，Wuhan bioengineeringinstitute，Hubei Wuhan430415，China）

Heat-resistance and acid-resistance of pullulanase from Halococcus sp.Z1,Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis was studied.The pullulanase from Halococcus sp.Z1 was purified by ammonium sulfate fractionation, dialysis,DEAE-SephadexA25 ion-exchange chromatographyand sephadexG-100 gel filtration,and partial enzymatic properties was examined.It is stable below65℃and within the pH range from4.0～7.5.Its optical temperature is 60℃and optical pH is 5.0～5.4.The purified pullulanase was demonstrated bySDS-PAGE tobe a homogeneous protein.The molecularweightofpullulanaseis8.17×104，andtheMichaelisconstantis0.24 mg/mL.

pullulanase；purification；property

TS201.2+5

A

1673-6044（2014）01-0037-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.01.012

*周念波，男，1979年出生，2011年畢業(yè)于湖北大學(xué)生化與分子生物學(xué)專業(yè)，碩士，工程師。

2013-12-06