龔磊，吳殷琦，何玉財，王茜，王利群，張躍，劉海軍，朱慶偉

（1 常州大學(xué)制藥與生命科學(xué)學(xué)院生物工程研究室，江蘇 常州 213164；2 中國石油吉林石化分公司研究院，吉林 吉林，132021）

木薯渣是木薯淀粉加工過程中所剩下的固體廢料，含有較高的木質(zhì)纖維素，少量的淀粉和蛋白，存在很大的再利用價值。如不加處理直接丟棄既造成浪費又占用土地，而且木薯渣在貯存過程中易酸化，產(chǎn)生的腐敗氣味會污染周邊環(huán)境，所含廢水也會對土壤、植被造成破壞[1]。厭氧發(fā)酵木薯渣生產(chǎn)生物氣（如甲烷）是高效利用木薯渣的一種途徑。然而，利用后所形成的沼渣仍含有大量的木質(zhì)纖維素。如不經(jīng)合理處理，殘渣仍會對環(huán)境造成污染。但是，纖維素和半纖維素被較難降解的木質(zhì)素所包裹，而且纖維素有較高的結(jié)晶度，分子內(nèi)與分子間存在大量的氫鍵，這對其生物降解會產(chǎn)生一定的抑制作用[2-3]。因此，對纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理顯得尤為重要。

許多方法用于預(yù)處理木質(zhì)纖維素，主要包括物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)聯(lián)合法和生物法[4-6]，但其總體上存在能耗和成本高、環(huán)境污染等問題[5-7]。其中，高能輻射和微波處理成本較高，很難大規(guī)模生產(chǎn)；稀酸法雖已經(jīng)規(guī)模化，但存在產(chǎn)率低、產(chǎn)物中的有害副產(chǎn)物影響進(jìn)一步生物轉(zhuǎn)化利用；汽爆預(yù)處理工藝的費用較低，但處理品質(zhì)不穩(wěn)定；生物法對環(huán)境友好，能耗低且副產(chǎn)物少，但轉(zhuǎn)化效率低、木質(zhì)素分解酶類的酶活較低，作用周期長[5-8]。采用目前的常規(guī)方法難以將纖維素高效轉(zhuǎn)化成糖類化合物，這已成為制約纖維素高效轉(zhuǎn)化利用的瓶頸。因此，尋求一種綠色環(huán)保的纖維素新溶劑成為人們關(guān)注的焦點。近年來，離子液體由于具有不易氧化、不易揮發(fā)、溶解能力強、對水和空氣穩(wěn)定和無毒環(huán)保等特點，因而被作為溶解和加工纖維素的新型綠色溶劑[9]。在不含水條件下的離子液體溶解預(yù)處理過程中，與離子液體接觸的部分纖維素能很快溶解[10]。然而，由于離子液體有一定的黏度，易形成溶解的纖維素漿液包裹著未溶解的纖維素的狀態(tài)，使得內(nèi)層纖維素未完全溶解，因而存在溶解不均勻現(xiàn)象[11]。高黏度的離子液體會導(dǎo)致其在反應(yīng)器壁上黏附，從而造成后處理困難，且嚴(yán)重影響反應(yīng)體系的傳質(zhì)擴散，導(dǎo)致溶解效果變差[12]?？梢?，降低離子液體黏度、減少離子液體用量并實現(xiàn)纖維素原料的高效預(yù)處理是值得選擇的技術(shù)。

本研究首次利用低黏度的離子液體1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯鹽（[Mm im]DMP）和少量的稀鹽酸混合液預(yù)處理木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣，該方法可使得纖維素充分膨脹而溶解更完全，更加高效地預(yù)處理纖維素原料。

1 實驗部分

1.1 主要原料和試劑

木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣，購于沈陽市東北化工原料商場，經(jīng)粉碎處理后殘渣粉的平均粒徑為0.2mm。測得其組分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）：纖維素 31%、半纖維素12%、木質(zhì)素14%、其他組分43%。離子液體1,3-二甲基咪唑磷酸二甲酯鹽（[Mm im]DMP），純度＞99%，購于上海成捷化學(xué)有限公司；纖維素酶（產(chǎn)品號C-2730），購于Sigma公司；其他試劑均為分析純，市售。

1.2 主要儀器

JSM-6360LA冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，JEOL日本； PROTéGé 460 紅外光譜儀配ATR附件，Nicolet美國；BreezeTM2高效液相色譜儀，Waters 美國；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 EF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫?fù)u床THZ-072HT，上海博彩生物科技有限公司；紫外可見分光光度計Gold S53，上海棱光技術(shù)有限公司；真空干燥箱DZF-6020型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 [Mmim]DMP-鹽酸-水體系預(yù)處理木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣

稱取一定量的[Mm im]DMP、鹽酸和水于100m L三口燒瓶中，混合均勻后，再加入干燥的殘渣（液∶固=20∶1，質(zhì)量比），在90～130℃條件下機械攪拌進(jìn)行油浴加熱處理，反應(yīng) 15～120min后停止加熱并取出，加入蒸餾水反復(fù)洗滌纖維素溶液，沉降得到再生纖維素，同時回收離子液體。抽濾后將濾渣烘干備用。

1.4 酶解糖化

在50m L錐形瓶中，分別加入0.050mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 值4.8），纖維素酶（60 FPU/g底物），再生殘渣終濃度為 20g/L，在 50℃和 160 r/m in的恒溫?fù)u床上振蕩反應(yīng)。在反應(yīng)不同時間間隔，取200μL反應(yīng)液分析糖濃度。以未處理的木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣糖化作對照。

1.5 糖化液分析方法

1.5.1 分光光度法測定還原糖濃度

取100μL上清糖化液和1.5m L 3,5-二硝基水楊酸溶液于試管中，沸水浴反應(yīng)5min，冷卻后再向試管中加入蒸餾水5m L，充分混勻。在520nm波長下用紫外可見分光光度計進(jìn)行比色分析。

1.5.2 高效液相色譜法測定葡萄糖濃度

采用美國Waters公司生產(chǎn)的BreezeTM2系列高效液相色譜儀分析糖化液中葡萄糖的含量；色譜柱型號為Aminex?HPX-87H柱（Bio-Rad 美國），柱溫65℃，流動相5mmol/L H2SO4，流速0.6m L/min；泵為1515型（Waters公司），示差折光檢測器為2414型（Waters公司）；進(jìn)樣量20μL。

1.5.3 還原糖產(chǎn)率計算

2 結(jié)果與討論

2.1 各影響因素對預(yù)處理過程的影響

2.1.1 酸種類對預(yù)處理過程的影響

圖1 酸種類對糖化活性的影響

在預(yù)處理溫度和預(yù)處理時間分別為 130℃和30min條件下，考察不同種類的酸輔助[Mm im]DMP預(yù)處理木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣的影響，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)加入少量的酸處理后，糖化活性明顯增加，說明酸在[Mmim]DMP預(yù)處理過程中起促進(jìn)作用。在H+濃度相等的1.5% HCl和2.1% H2SO4條件下，HCl輔助[Mmim]DMP預(yù)處理比H2SO4得到了較高的糖化活性。這可能是HCl比H2SO4更易使半纖維素移除，且Cl-電負(fù)性比SO強，與纖維素分子上的羥基形成了氫鍵，從而破壞了纖維素分子間或分子內(nèi)的氫鍵，提高了其糖化活性[13-14]。

2.1.2 HCl濃度和預(yù)處理溫度對預(yù)處理過程的影響

在預(yù)處理時間30min、離子液體含水量20%的條件下考察HCl濃度和預(yù)處理溫度對糖化活性的影響，結(jié)果如圖2所示。在4.5% HCl、處理溫度90℃下，糖化活性最低，而在較高溫度（110℃、130℃）下，HCl濃度的增加能夠促進(jìn)錯誤！未找到引用源。預(yù)處理過程，說明HCl只有在高溫下才能發(fā)揮預(yù)處理作用。因此，溫度在預(yù)處理過程中是一個重要因素，提高溫度可以加快分子運動，使離子液體和HCl擴散并滲透到纖維素內(nèi)部的能力加強，加快纖維素的溶解速度[15]。因此，130℃為最適的預(yù)處理溫度。Li等[16]發(fā)現(xiàn)離子液體[Mmim]DMP（無水）預(yù)處理玉米芯的最適溫度也為 130℃。很明顯，[Mmim]DMP-HCl-水預(yù)處理雖然含一定量的水，但無須提高預(yù)處理溫度仍有良好的預(yù)處理效果。

2.1.3 預(yù)處理時間對預(yù)處理過程的影響

圖2 HCl濃度和預(yù)處理溫度對糖化活性的影響

在1.5% HCl、離子液體含水量20%、預(yù)處理溫度 130℃條件下，考察預(yù)處理時間對糖化活性的影響，結(jié)果見圖3。預(yù)處理時間低于30m in時，隨著預(yù)處理時間的延長，木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣的糖化活性逐漸提高，30m in后延長時間對其糖化活性的影響較小。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是：隨著時間的延長，木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣中的木質(zhì)素和半纖維素不斷地溶入離子液體[Mm im]DMP中，時間越長，溶解量越大，HCl中的Cl-同纖維素分子內(nèi)、分子間形成的氫鍵作用不斷加強，進(jìn)而破壞纖維素分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用，導(dǎo)致纖維素結(jié)晶區(qū)變小，纖維素酶的可及度增加，因而得到較高的糖化活性[17]。在預(yù)處理時間為 30～120m in時，糖化活性出現(xiàn)了最大值且趨于平衡?？赡苁窃诖藯l件下，木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣中的纖維素在離子液體[Mmim]DMP中的松散程度達(dá)到了飽和。因此選擇的最適預(yù)處理時間為30m in。

圖3 預(yù)處理時間對糖化活性的影響

2.1.4 離子液體含水量對預(yù)處理過程的影響

離子液體水溶液不僅能夠降低離子液體的黏度，還可以減少離子液體的用量[11]。另外有文獻(xiàn)[18]指出，離子液體水混合體系中，水的離子積常數(shù)KW比純水KW大3個數(shù)量級，即H+濃度大大增加，有利于纖維素的溶解。如圖4所示，當(dāng)體系含水量為5%～20%時，糖化活性逐漸增加，20%后開始下降，原因可能是過量水的稀釋作用降低了預(yù)處理體系的酸性，且水分子可以與纖維素鏈競爭離子液體并與之形成氫鍵，使離子液體對纖維素的溶解能力減弱[19]。因此，離子液體的含水量對離子液體溶解作用影響較大，20%含水量預(yù)處理效果最好。很明顯，預(yù)處理體系中含有一定量的水，不僅可降低預(yù)處理體系的黏度，還可以減少離子液體用量并實現(xiàn)纖維素原料的高效預(yù)處理。另外，由于離子液體具有可重復(fù)利用特性[9]，循環(huán)利用的離子液體性能幾乎沒有降低，仍可保持良好的預(yù)處理能力，因此可降低預(yù)處理成本。由此可見，[Mm im]DMP-HCl-水（78.5∶1.5∶20，質(zhì)量比） 預(yù)處理體系具有良好的應(yīng)用前景。

2.2 掃描電鏡與紅外光譜表征分析

為了考察預(yù)處理前后纖維素的形貌和分子結(jié)構(gòu)特征，對未處理的和再生的木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣進(jìn)行SEM、FT-IR定性分析。掃描電鏡圖5(a)和(b)分析表明，木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣經(jīng)預(yù)處理后，纖維素表面有很多裂痕和裂紋而變得粗糙，結(jié)構(gòu)疏松多孔，且高級結(jié)構(gòu)被破壞。

圖4 預(yù)處理體系含水量對糖化活性的影響

圖5 未處理和再生的殘渣SEM圖

殘渣的FT-IR圖見圖6。由圖6可見，木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣在預(yù)處理前后的紅外吸收峰及譜帶基本相同，即沒有新的官能團(tuán)出現(xiàn)，說明預(yù)處理后的化學(xué)成分并沒有改變。對比曲線 a 和 b，b在1735cm-1處的半纖維素的特征吸收峰[20]變?nèi)趿?，?509cm-1和 1633cm-1處的木質(zhì)素特征吸收峰[21]也明顯變?nèi)酢Ｕf明半纖維素和木質(zhì)素在預(yù)處理后都發(fā)生一定程度地降解。a在3400cm-1具有強—OH吸收峰，預(yù)處理后由于殘渣纖維素中的結(jié)合水的量減少導(dǎo)致該峰后移，峰型變寬且強度變?nèi)鮗22]。未處理的殘渣在 2922cm-1附近的峰是纖維素結(jié)晶度的表現(xiàn)[23]。經(jīng)預(yù)處理后，峰型變圓鈍，原因是由于半纖維素的去除導(dǎo)致纖維素的相對含量的增大。

圖6 未處理和再生的殘渣FT-IR圖

2.3 糖化進(jìn)程

進(jìn)一步對未處理的和預(yù)處理的木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣進(jìn)行糖化進(jìn)程考察（圖7）。經(jīng)過預(yù)處理之后，木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣糖化率明顯提高。原因是預(yù)處理殘渣部分纖維素的結(jié)晶度降低（圖6），纖維素表面的致密結(jié)構(gòu)被破壞而變得松散[圖5(b)]，為纖維素酶的吸附提供更多的結(jié)合位點，從而提高了糖化率。糖化 24h，預(yù)處理的殘渣還原糖和葡萄糖濃度達(dá)到4.6g/L和3.8g/L。隨著時間的延長，糖化率緩慢增加。96h后，還原糖和葡萄糖濃度分別為6.1g/L和 5.0g/L，分別比未處理的殘渣提高 1.3倍和 1.5倍，可見木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣是可被高效糖化的。

3 結(jié) 論

圖7 糖化進(jìn)程

本研究首次以木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣作為纖維素原料，通過一種新型的[Mm im]DMP-HCl-水體系作為纖維素溶劑進(jìn)行高效預(yù)處理，實現(xiàn)其高效糖化。[Mmim]DMP-HCl-水（78.5∶1.5∶20，質(zhì)量比）體系在預(yù)處理溫度130℃、預(yù)處理時間30min條件下預(yù)處理木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣，再生的纖維素原料（20g/L）糖化 96h，還原糖和葡萄糖濃度分別為6.1g/L和5.0g/L。優(yōu)化的預(yù)處理體系可以減小離子液體的黏度和用量，不僅克服了純離子液體預(yù)處理的缺點，還節(jié)約了成本，為木薯渣厭氧發(fā)酵殘渣等纖維素原料的高效預(yù)處理提供了新思路。

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