曾慧妍，曹 瑛，薛耀明△

（1．廣東省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣州510120；2．南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝病科，廣州510000）

糖尿病患者存在易感染的特點(diǎn)，既往研究顯示這與白細(xì)胞功能受損密不可分［1-2］。外周血白細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的主要組成部分，其殺菌能力在抵御外界微生物侵襲方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。白細(xì)胞殺滅細(xì)菌的主要手段為呼吸爆發(fā)。因此，呼吸爆發(fā)功能正常與否決定了白細(xì)胞是否能有效實(shí)現(xiàn)機(jī)體免疫，減少感染發(fā)生。同時(shí)，呼吸爆發(fā)功能與糖代謝存在密切聯(lián)系。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）作為戊糖磷酸途徑的關(guān)鍵酶，為呼吸爆發(fā)提供必需物質(zhì)——還原型輔酶Ⅱ（NADPH）。因此，G6PD活性直接關(guān)系到呼吸爆發(fā)功能的正常發(fā)揮。作者的前期研究已發(fā)現(xiàn)，與健康成人相比，2型糖尿病患者外周血白細(xì)胞G6PD活性及細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平均明顯降低，存在明顯的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙［3］。那么，正常人外周血白細(xì)胞在高濃度葡萄糖培養(yǎng)環(huán)境下是否也會(huì)和糖尿病患者一樣出現(xiàn)白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙呢？白細(xì)胞呼吸爆發(fā)改變是否與葡萄糖培養(yǎng)濃度有關(guān)？本實(shí)驗(yàn)擬以健康成人外周血離體白細(xì)胞為研究對(duì)象，探討高糖環(huán)境培養(yǎng)濃度與健康成人白細(xì)胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究糖尿病患者易感染的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1．1 一般資料 收集健康成人外周血標(biāo)本24例，其中，男14例，女10例，平均年齡（25．0±1．3）歲，為南方醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院健康體檢者。無(wú)糖尿病家族史、無(wú)G6PD缺乏癥家族史。無(wú)冠心病、肝腎功能不全等慢性病史。無(wú)惡性腫瘤、結(jié)締組織病、器官移植術(shù)后、白血病等需使用細(xì)胞毒制劑和非選擇性免疫抑制劑的病史。近期無(wú)服藥史。白細(xì)胞計(jì)數(shù)在正常范圍（4～10）×109／L；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibcol公司；胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Hyclone公司；G6PD活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中山生物工程有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 收集健康成人外周血標(biāo)本（EDTA抗凝）后，使用紅細(xì)胞裂解液進(jìn)行外周血白細(xì)胞的分離，離心后取管底白色沉淀，加入含有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕輕吹打使其徹底混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加青霉素、鏈霉素為1×105U／L。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要隨機(jī)分為4組：5 mmol／L組（5 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）、15 mmol／L組（15 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）、25 mmol／L組（25 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）、高滲對(duì)照組（L-GLU組，20 mmol／L L-葡萄糖＋5 mmol／L D-葡萄糖培養(yǎng)）。培養(yǎng)8 h后，每組分別取樣本檢測(cè)G6PD活性及ROS產(chǎn)量。

1．3 檢測(cè)指標(biāo) 四氮唑藍(lán)定量測(cè)定法檢測(cè)G6PD活性、熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量，操作均按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各組細(xì)胞裝載DCFH-DA熒光探針后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。每例樣本隨機(jī)抽取30個(gè)細(xì)胞，用Leica專用圖像分析處理軟件，對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光密度進(jìn)行分析。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量的比較 5 mmol／L組與LGLU組的G6PD活性及ROS產(chǎn)量均無(wú)明顯差異（均P＞0．05）。與5 mmol／L組相比，15 mmol／L組及25 mmol／L組均出現(xiàn)不同程度的G6PD活性降低及ROS產(chǎn)量減少，且25 mmol／L組G6PD活性及ROS產(chǎn)量均顯著低于15 mmol／L組（F＝9．095，P＜0．001），見(jiàn)表1。

2．2 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量變化 4組ROS熒光激光共聚焦顯微鏡下觀察培養(yǎng)8 h后，5 mmol／L組及L-GLU組細(xì)胞內(nèi)熒光無(wú)明顯改變，保持中等強(qiáng)度熒光，多數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核，部分細(xì)胞可見(jiàn)高強(qiáng)度熒光。15 mmol／L組及25 mmol／L組細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)熒光分布不均，熒光強(qiáng)度弱，個(gè)別細(xì)胞肉眼難以辨認(rèn)細(xì)胞外形（圖1）。

表1 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量變化（±s）

表1 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量變化（±s）

＊：P＜0．01，與5 mmol／L組比較；＃：P＜0．01，與15 mmol／L組比較。

組別 G6PD活性 ROS 產(chǎn)量5 mmol／L組1．37±0．14 196．73±19．79 15 mmol／L組 0．98±0．13＊ 130．30±17．59＊25 mmol／L組 0．73±0．09＊＃ 106．48±18．09＊＃L-GL U組 1．32±0．11 197．68±19．34 F 53．601 1 111．634 P 0．000 0．000

圖1 各組ROS熒光變化

2．3 4組G6PD活性及ROS產(chǎn)量與葡萄糖培養(yǎng)濃度的相關(guān)性分析 培養(yǎng)8 h后，5 mmol／L組、15 mmol／L組及25 mmol／L組G6PD活性逐漸降低，ROS產(chǎn)量亦隨之減少，G6PD活性、ROS產(chǎn)量分別與葡萄糖培養(yǎng)濃度呈負(fù)相關(guān)（r＝-0．916，P＜0．001；r＝-0．951，P＜0．001）。而L-GLU組ROS產(chǎn)量及G6PD活性與葡萄糖濃度之間無(wú)相關(guān)性。

3 討 論

糖尿病患者易感染部分歸咎于白細(xì)胞的吞噬殺菌作用降低。吞噬細(xì)胞的吞噬殺菌作用降低是糖尿病患者免疫功能紊亂的主要表現(xiàn)之一，這為細(xì)菌的侵入及繁殖創(chuàng)造了有利條件。大量研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者血中的中性粒細(xì)胞的黏附、趨化、吞噬和殺菌能力均顯著低于正常對(duì)照組，提示其易感染性與白細(xì)胞功能有一定的關(guān)系［4-5］。有學(xué)者將糖尿病患者外周血白細(xì)胞與葡萄糖和胰島素一起培養(yǎng)可恢復(fù)其趨化性，提示其功能與糖代謝有關(guān)。血糖控制不良的糖尿病患者，其白細(xì)胞殺菌能力明顯低于血糖控制良好者，提示白細(xì)胞內(nèi)的殺菌能力與血糖控制程度有關(guān)。但高血糖改變白細(xì)胞功能的具體機(jī)制尚未有明確答案，目前關(guān)于該方面的國(guó)內(nèi)外研究甚少。既往有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與健康成人相比，糖尿病患者中性粒細(xì)胞的吞噬能力明顯下降且與血糖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，高糖環(huán)境是導(dǎo)致白細(xì)胞吞噬功能降低的重要因素［6］。

呼吸爆發(fā)是白細(xì)胞激活后行使殺菌功能的主要途徑。當(dāng)白細(xì)胞被激活后，能產(chǎn)生大量的ROS，并通過(guò)ROS殺死入侵的微生物和病原體。由于在這個(gè)過(guò)程中，白細(xì)胞的耗氧量急劇上升，甚至可達(dá)正常量的2～20倍，葡萄糖的代謝活動(dòng)也明顯增加，故將該現(xiàn)象稱為“呼吸爆發(fā)”。NADPH作為呼吸爆發(fā)反應(yīng)的惟一供氫體，是呼吸爆發(fā)的必需物質(zhì)，其產(chǎn)量直接影響ROS的產(chǎn)生。而NADPH的生成僅僅來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖途徑。因此，G6PD作為磷酸戊糖途徑的限速酶，其活性對(duì)于呼吸爆發(fā)的正常發(fā)揮就顯得尤為重要。前期研究發(fā)現(xiàn)，與健康成人比較，2型糖尿病患者存在明顯的白細(xì)胞功能障礙，該結(jié)果與既往研究結(jié)果相符［4］。在本研究中，通過(guò)離體外周血白細(xì)胞培養(yǎng)再次驗(yàn)證了高糖培養(yǎng)環(huán)境對(duì)白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)8 h后，15 mmol／L組和25 mmol／L組均出現(xiàn)G6PD活性及ROS產(chǎn)量顯著下降，而5 mmol／L組無(wú)明顯改變，L-GLU組用20 mmol／L的L-葡萄糖＋5 mmol／L的D-葡萄糖聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞作為高滲對(duì)照則排除了滲透壓引起各指標(biāo)的改變。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述葡萄糖濃度增高可導(dǎo)致白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能降低的觀點(diǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)基葡萄糖濃度的升高，健康成人白細(xì)胞的G6PD活性減弱，ROS釋放量也隨之下降且G6PD活性、ROS產(chǎn)量分別與培養(yǎng)基葡萄糖濃度呈負(fù)相關(guān)，提示細(xì)胞吞噬殺菌功能與其所處環(huán)境有關(guān)，高糖環(huán)境對(duì)離體培養(yǎng)的白細(xì)胞是一個(gè)刺激因素，糖濃度越高刺激強(qiáng)度越大。因此，推測(cè)高糖環(huán)境中G6PD活性降低導(dǎo)致細(xì)胞吞噬殺菌功能低下可能是糖尿病患者易于感染的主要原因之一。目前對(duì)兩者關(guān)系的研究較少，國(guó)外僅Alba-Loureiro等［7］對(duì)此進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)糖尿病可導(dǎo)致小鼠白細(xì)胞代謝與功能的明顯改變，與正常小鼠相比，糖尿病小鼠的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞G6PD活性均明顯降低，提出白細(xì)胞G6PD缺乏可導(dǎo)致吞噬功能障礙、殺菌能力下降及過(guò)氧化物生成減少的觀點(diǎn)，這與Moutschen［8］的觀點(diǎn)一致。國(guó)內(nèi)暫未發(fā)現(xiàn)類似的研究報(bào)道。本研究通過(guò)人離體細(xì)胞培養(yǎng)，對(duì)葡萄糖培養(yǎng)濃度、白細(xì)胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能三者的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行了探討，其結(jié)果與上述國(guó)外的研究結(jié)果相符［7-8］。

結(jié)合作者的前期研究，本研究從人離體細(xì)胞培養(yǎng)和臨床研究?jī)蓚€(gè)層面對(duì)糖尿病血糖控制水平、白細(xì)胞G6PD活性及呼吸爆發(fā)功能三者的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行了初步探討。然而，高糖是否單純通過(guò)抑制G6PD活性來(lái)抑制白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能？是否還通過(guò)其他機(jī)制來(lái)抑制白細(xì)胞呼吸爆發(fā)呢？高糖導(dǎo)致G6PD活性降低的機(jī)制是什么？有待進(jìn)一步的研究。

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