周 政，陳大鵬

（1．重慶三峽中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶萬(wàn)州404000；2．重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶400014）

隨著人們的行為方式、飲食結(jié)構(gòu)及自然環(huán)境的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)。盡管作用機(jī)制仍未完全清楚，但多數(shù)研究認(rèn)為K-ras基因突變是結(jié)直腸癌發(fā)生的早期事件，在結(jié)腸腺瘤癌變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。西方人種結(jié)、直腸癌原發(fā)灶組織的K-ras基因突變率為30%～60%［1］，而東方人種則為17%～28%［2］。西妥昔單抗競(jìng)爭(zhēng)性阻斷表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和其他配體，從而抑制癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，療效比較明確。但研究表明K-ras基因突變可以導(dǎo)致對(duì)西妥昔單抗原發(fā)性耐藥，檢測(cè)K-ras基因點(diǎn)突變是保證分子靶向治療有效的關(guān)鍵。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2010年1～11月，隨機(jī)選擇本院初診的212例結(jié)直腸癌患者。其中，男144例，女68例。按年齡分組：19～44歲，70例；45～59歲，52例；大于60歲，90例。按腫瘤部位分組：大腸彌散分布4例，直腸腫瘤108例，結(jié)腸腫瘤100例；按腫瘤分化程度分組：低分化腫瘤60例，中分化腫瘤144例，高分化腫瘤8例；按Dukes病理診斷分期分組：A期48例，B期72例，C期72例，D期20例。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移84例。所有患者的臨床診斷均由病理組織活檢、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查確診。按照2∶1的比例設(shè)對(duì)照，健康對(duì)照組由106名健康體檢人員組成。

1．2 方法

1．2．1 標(biāo)本處理 取受試者外周血3～5 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，3 000 r／min離心15 min分離血漿，-80℃冷凍保存。用Hep G2細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照（Hep G2細(xì)胞DNA穩(wěn)定地含有K-ras 12密碼子突變的SW480 DNA）。

1．2．2 DNA提取 采用Qiagen試劑提取血漿游離DNA。紫外分光光度儀測(cè)定DNA含量，應(yīng)用3～5 mL外周血可獲得約10μg游離DNA。

1．2．3 擴(kuò)增 （1）檢測(cè)基因組DNA看家基因globin：引物Globin-R：ATC AAG CGT CCC ATA GAC TCA C，Globin-F：GAT CTG TCC ACT CCT GAT GCT G，PCR產(chǎn)物196 bp。擴(kuò)增條件：94℃3 min，然后依次94℃30 s、59℃30 s、72℃30 s，共35次循環(huán)，最后72℃10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10μL產(chǎn)物進(jìn)行20 g／L瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀觀察結(jié)果。（2）RE-PCR［3-4］：第1輪PCR體 系：1．5μmol／L Mg Cl2，1×PCR buffer，0．5 U Hot-Start Taq，200μmol／L d NTP，0．1 μmol／L pri mers［L-Ext（5′GCT CTT CGT GGT GTG GTG TCC ATA TAA ACT TGT GGT AGT TGG ACC T 3′），RExt（5′GCT CTT CGT GGT GTG GTG TCC CGT CCA CAA AAT GAT TCT GA 3′）］。擴(kuò)增條件：95℃15 min，94℃30 s、52℃30 s，20次循環(huán)，72℃5 min 1次循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用Bst NI消化。1／20的消化產(chǎn)物進(jìn)行第2輪Hot-Start PCR：1 μmol／L引物L(fēng)-Bst（5′ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT 3′），R-Bst（5′GTC CAC AAA ATG ATC CTG GAT TAG C 3′）。擴(kuò)增條件：95℃15 min，94℃30 s、56℃30 s，40次循環(huán)，72℃5 min 1次循環(huán)。87 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物用Bst NI消化后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。K-ras陽(yáng)性認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)：終產(chǎn)物出現(xiàn)71 bp大小的片段。K-ras突變最終經(jīng)DNA測(cè)序確定。

1．2．4 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒（組織DNA和血漿游離DNA）購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；Premix Taq、Hot-Start Taq、Bst NI購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。紫外分光光度儀、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀及凝膠成像儀為美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0軟件進(jìn)行分析處理，分類(lèi)資料統(tǒng)計(jì)分析采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 血漿游離DNA提取結(jié)果 以看家基因globin擴(kuò)增產(chǎn)物電泳作為血漿游離DNA提取物的鑒定結(jié)果。212例初診患者標(biāo)本中，血漿游離DNA均提取成功。106例健康對(duì)照組中均無(wú)血漿游離DNA提出（圖1）。腫瘤中心組織均提取出DNA。

圖1 血漿游離DNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 K-ras野生型檢測(cè)圖譜

2．2 腫瘤中心病理組織K-ras突變檢測(cè)結(jié)果 212例患者中發(fā)生K-ras突變（12密碼子）的有33例（15．57%，33／212）。本研究共發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變類(lèi)型，12位密碼子由GGT突變?yōu)镚AT（圖2、3）；12位密碼子由GGT突變?yōu)镚TT（圖2、3）。

圖3 K-ras突變型檢測(cè)圖譜

表1 血漿游離DNA K-ras突變檢測(cè)結(jié)果及與 病理組織、臨床特征的關(guān)系

2．3 血漿游離DNA K-ras突變檢測(cè)結(jié)果及與病理組織、臨床特征的關(guān)系 212例患者同時(shí)進(jìn)行活檢標(biāo)本和血漿游離DNA K-ras。檢測(cè)結(jié)果34例患者血漿游離K-ras突變陽(yáng)性（16．04%），33例患者病理活檢標(biāo)本陽(yáng)性（15．57%），二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝2．31，P＝0．31）。其中，1例患者腫瘤呈大腸彌散分布，2次病理組織活檢結(jié)果均為陰性，而其血漿游離DNA分析結(jié)果為陽(yáng)性，經(jīng)多次活檢后確定為黏液腺癌。K-ras基因突變與腫瘤的部位（結(jié)腸、直腸、彌散分布）無(wú)明顯關(guān)系（χ2＝3．34，P＝0．61）；與結(jié)直腸癌分化程度（高、中、低）無(wú)明顯關(guān)系（χ2＝2．38，P＝0．29）；與結(jié)直腸癌病理分期（Dukes分期）無(wú)明顯關(guān)系（χ2＝2．84，P＝0．38）；與結(jié)直腸癌有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯關(guān)系（χ2＝0．98，P＝0．37）；與結(jié)直腸癌患者年齡無(wú)明顯關(guān)系（χ2＝1．86，P＝0．39）。見(jiàn)表1。

3 討 論

腫瘤細(xì)胞持續(xù)釋放DNA入血，導(dǎo)致外周血DNA增高且存在與原發(fā)腫瘤組織一致的分子生物學(xué)改變［5］。本研究結(jié)果顯示腫瘤患者血液中確實(shí)存在健康人群不存在或是不能被檢出的游離DNA。血漿游離DNA的檢出量也與疾病進(jìn)程相關(guān)。本研究在初診患者中均檢測(cè)到血漿游離DNA，而在疾病緩解期的患者中則未檢出。在病情逐漸好轉(zhuǎn)的情況下，患者血漿中的游離DNA濃度逐漸減低。因此，檢測(cè)血漿游離DNA有助于腫瘤患者疾病進(jìn)展情況的評(píng)估以及預(yù)后判斷。

ras基因產(chǎn)物參與控制基因轉(zhuǎn)錄的激酶信號(hào)傳導(dǎo)路徑，因而能調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。ras蛋白隨ras基因的改變而發(fā)生變化，其結(jié)果是發(fā)生改變的ras蛋白不再具有裂解和釋放GTP分子的能力，這種改變導(dǎo)致該信號(hào)傳導(dǎo)路徑始終處于“開(kāi)通”的狀態(tài)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)和增生。ras過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致持續(xù)的細(xì)胞增殖，這是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵一步，同時(shí)涉及多種腫瘤的發(fā)生，其中最常見(jiàn)的是結(jié)直腸腫瘤。結(jié)直腸腫瘤的治療，外科手術(shù)是長(zhǎng)期已確定的治療方案，而新興的腫瘤分子靶向治療是一種全新的生物治療模式［6-7］。K-ras基因是公認(rèn)的癌基因，參與EGFR信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程?；蛲蛔兓颊呖笶GFR治療預(yù)后較差，導(dǎo)致不良反應(yīng)，增加治療費(fèi)用；野生型患者就很可能從抗EGFR藥物治療中獲益。因此，《美國(guó)國(guó)立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)（NCCN）結(jié)直腸癌臨床實(shí)踐指南》（2008年第3版）明確提出檢測(cè)K-ras基因。西妥昔單抗阻斷K-ras蛋白的表達(dá)，將凋亡信號(hào)傳遞到胞核內(nèi)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；颊邔?duì)西妥昔單抗原耐藥可能與K-ras基因突變有關(guān)［8］，指導(dǎo)分子靶向治療的關(guān)鍵即是檢測(cè)K-ras基因點(diǎn)突變的存在與否。針對(duì)K-ras基因點(diǎn)突變的檢測(cè)，該研究發(fā)現(xiàn)血漿游離DNA與病理活檢標(biāo)本具有相同的陽(yáng)性率、一致性和臨床意義。其中1例患者初次病理活檢未查出K-ras基因突變陽(yáng)性，而其相應(yīng)的血漿游離DNA查出K-ras基因突變陽(yáng)性，患者經(jīng)再次活檢后檢測(cè)出K-ras基因突變陽(yáng)性。分析其原因：該例患者病變呈大腸彌散分布，造成了取材的困難。因此，在未獲得病理證據(jù)時(shí)，血漿游離DNA的檢測(cè)能夠提供重要參考價(jià)值，為臨床的早期診斷、輔助診斷提供幫助，同時(shí)也為患者的個(gè)體化治療提供指導(dǎo)性的依據(jù)。全身各器官均可釋放DNA入血，檢測(cè)血漿游離DNA能夠反映與體內(nèi)腫瘤相關(guān)的異常基因，是腫瘤基因診斷的一種新方法。

本研究結(jié)果顯示K-ras基因突變（12密碼子）突變率為15．57%，12密碼子突變有2種突變方式（12密碼子由GGT突變?yōu)镚AT；12密碼子由GGT突變?yōu)镚TT），與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。K-ras基因突變與患者年齡、Dukes分期、分化程度、腫瘤部位、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性［10-13］。但也有文獻(xiàn)［14］報(bào)道Dukes C期發(fā)生K-ras突變頻率最高，結(jié)腸腫瘤發(fā)生突變頻率比直腸高。

腫瘤組織與血漿K-ras基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），血漿克服了組織標(biāo)本取材困難的弊端。通過(guò)血漿游離DNA檢測(cè)K-ras基因突變，方便、無(wú)創(chuàng)、快捷，能更好地應(yīng)用于分子靶向藥物的選擇和臨床綜合治療。

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