鄢春暉，陳 林，袁蔓莉，周 曉

（重慶市第四人民醫(yī)院婦產(chǎn)科400014）

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）屬于乳多空病毒科的乳頭瘤空泡DNA病毒，定向感染人類皮膚及黏膜組織，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖，表現(xiàn)為尋常疣、生殖器疣（尖銳濕疣）等癥狀。目前已鑒定出100多種亞型，其中40 多種與生殖器皮膚黏膜的病變有關(guān)，根據(jù)其致癌性分為高危型和低危型2 類，前者常引起宮頸癌等惡性病變，后者常引起尖銳濕疣等良性病變。流行病學研究表明，高危型HPV的持續(xù)感染是引起宮頸癌的主要原因［1］。1999年，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）通過對22個國家一項研究顯示，在99.7%的宮頸癌組織中檢測到HPV-DNA［2］。

HPV基因序列的多樣性造成各地區(qū)H P V亞型的分布存在著一定的差異［3］，這些差異導致病毒DNA的結(jié)構(gòu)域或功能域發(fā)生變化，從而影響宿主對病毒的免疫應(yīng)答。因此，了解HPV亞型在不同地區(qū)的分布及感染情況，對HPV感染的診斷和防治具有重要意義。本文旨在通過對重慶地區(qū)12196例婦科門診患者HPV亞型感染情況的研究，為重慶地區(qū)HPV感染的流行病學研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年1月至2013年12月來本院婦產(chǎn)科門診就診的12196例女性患者為研究對象，291 人年齡不詳，其余年齡15～68歲，其中，≤25歲6266例，26～35歲3107例，36～45 歲1842例，≥46 歲690例。納入標準：患有1 種或幾種宮頸疾病，沒有做過宮頸切除手術(shù)，標本采集時不處于月經(jīng)期，除去復查患者。全部標本采集均由醫(yī)師征得患者同意并承諾保護患者隱私。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 標本采集前3 d 不得沖洗陰道，24h 內(nèi)不得有性行為，未處于經(jīng)期。用棉拭子將宮頸口過多的分泌物擦去，取出宮頸刷于宮頸口單向旋轉(zhuǎn)4～5 周，以獲得足量的上皮細胞，然后將其放入盛有生理鹽水的采集管中，2～8 ℃保存，7 d 內(nèi)檢測，-20 ℃保存不超過3 個月。

1.2.2 主要儀器與試劑HPV基因分型（23 型）檢測試劑盒（深圳亞能生物技術(shù)有限公司），MG96＋型PCR擴增儀（杭州朗基科學儀器有限公司），F(xiàn)YY-3 型分子雜交儀（興化市分析儀器廠）。

1.2.3 檢測方法 （1）HPV DNA提?。喝m頸細胞采集液1 mL 于1.5 mL離心管中，13000r／min 離心10 min，棄上清液。加入50μL 細胞裂解液，混勻，100 ℃煮沸10 min，13000 r／min 離心10 min，保留上清液備用。（2）PCR擴增：PCR反應(yīng)體系（深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供），PCR反應(yīng)液20μL，加入模板DNA 5μL，反應(yīng)前每管滴加1 滴礦物油。PCR溫控體系，50 ℃15 min，95 ℃10 min；94 ℃30 s，42 ℃90 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃5 min。（3）反向膜雜交：取15 m L離心管，放入標有樣本編號的膜條（應(yīng)在膜條編號處用中性筆標記），加入8 mL 雜交液［2 ×標準枸櫞酸鹽水（SSC），0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）］和25μL PCR產(chǎn)物，沸水浴10 min，取出，擰緊瓶蓋，50℃雜交90 min。取出膜條，放入盛有50 m L 洗滌液（0.5 ×SSC，0.1%SDS）的離心管，50℃洗膜10 min，陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品同步處理。（4）洗膜：按雜交液∶過氧化物酶（POD）＝2000∶1 配制孵育液（2 張膜條需4 m L POD，配制成8 m L孵育液，4 張膜可用6μL POD母液，配制成12mL 孵育液），室溫輕搖孵育30 min，棄掉孵育液。用雜交液室溫輕搖2 次，每次5 min。用0.1 mol 檸檬酸鈉溶液室溫輕洗1～2 min，同時配制顯色液，顯色液需新鮮配制，0.1 mol 檸檬酸鈉溶液∶四甲基聯(lián)苯胺（TMB）∶30% H2O2＝19 mL∶1 mL∶2 μL）。將膜條浸泡于顯色液中，避光顯色至少30 min，轉(zhuǎn)移至去離子水中浸泡即可觀察結(jié)果。

1.2.4 質(zhì)量控制 所有檢驗人員均經(jīng)過專業(yè)的培訓，擁有PCR上崗證件；實驗前對操作區(qū)進行30 min 紫外燈照射，檢驗設(shè)備和檢驗試劑均通過國家臨檢中心認證；每次實驗均設(shè)有陰性對照和陽性對照。

1.2.5 結(jié)果判定 膜條上有24 個圓形斑點，其中PC點為顯色質(zhì)控點，其他23 個斑點均有相應(yīng)HPV亞型所對應(yīng)的探針。每張膜條PC 位點處均應(yīng)有藍色斑點出現(xiàn)，此時結(jié)果的判讀視為成功，PC 位點不顯現(xiàn)藍色斑點則提示實驗失敗。陰性質(zhì)控的雜交膜條除PC 位點有藍色斑點外，其他位點均不出現(xiàn)顯色信號；陽性質(zhì)控品處PC位點出現(xiàn)顯色信號外，必須在相應(yīng)HPV基因型位點出現(xiàn)顯色信號，否則說明實驗失敗，提示PCR擴增或雜交失敗。

1.3 統(tǒng)計學處理HPV感染具有顯著的年齡差異性，為了更好地反應(yīng)不同年齡段間HPV感染的情況，參照文獻［4］發(fā)布的世界人口統(tǒng)計標準，將年齡分成4 組，≤25、26～35、36～45、≥46 歲。所有數(shù)據(jù)通過SPSS19.0 和Excel 2003 進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t 檢驗；計數(shù)資料以率或百分比表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各年齡段HPV感染情況 在受檢的12196例標本中，共檢測出3754例HPV陽性患者，檢出率為30.8%?！?5、26～35、36～45、≥46 歲受檢者HPV檢出率分別為31.6%、28.5%、28.8%和37.5%，不同年齡段HPV感染率呈現(xiàn)出“U”形曲線（圖1）。4 個年齡段中，≥46年齡段HPV感染率最高，與其他3組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝29.67，P＜0.05），見表1。

2.2 各年齡段HPV感染構(gòu)成比3754例陽性標中，各年齡段HPV單重感染率和多重感染率之間有差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝129.76，P＜0.05）。每個年齡組的主要感染構(gòu)成均為單重感染，其中36～45 歲年齡段單重感染率（78.15%）顯著高于其他年齡段；各年齡段多重感染患者中，以二重感染為主，≤25歲年齡段的三重和四重感染率顯著高于其他年齡段；在26～45 歲年齡段，多重感染率的分布呈下降趨勢，46 歲以后多重感染有所回升，見表2。

圖1 各年齡段HPV感染曲線

表1 各年齡段HPV感染情況統(tǒng)計表［n（%）］

表2 各年齡段HPV感染構(gòu)成比（%）

2.3 HPV陽性標本主要型別分布 本次研究檢測出全部23種亞型，其中高危型18 種，低危型5 種。3754例HPV陽性標本中，高危型感染數(shù)為2315（61.67%）例，排在前6 位的分別為HPV58（10.34%）、HPV16（10.24%）、HPV52（10.09%）、HPV56（6.49%）、HPV33（5.66%）、HPV18（4.56%）；低危型感染 數(shù) 為797（21.23%）例，前3位 為HPV6（10.70%）、HPV43（7.31%）、HPV11（4.60%）；高低?；旌细腥緮?shù)為642（17.10%），見表3。

表3 陽性標本中各主要型別HPV的分布

續(xù)表3 陽性標本中各主要型別HPV的分布

3 討 論

世界范圍內(nèi)，宮頸癌是一種較常見的婦女疾病，女性惡性腫瘤中排第2位，發(fā)病率高達187／1000000，其中超過85.00%的感染者存在于發(fā)展中國家［4-5］。大量的流行病學研究表明HPV的持續(xù)感染在宮頸癌變中扮演著重要的角色。HPV-DNA檢測呈陽性的婦女患上宮頸癌癥風險高于呈陰性的婦女50 倍［6］。HPV感染已成為最常見的性傳播疾病之一，調(diào)查顯示，至少有50.00%的人一生中至少感染1次生殖器HPV，美國每年大約有26 萬人在45 歲之前就感染過HPV［4］。HPV的分布具有地域差異性，各地區(qū)感染率相差很大，世界范圍內(nèi)［7］非洲感染率為22.10%，中美洲和墨西哥為20.40%，歐洲8.19%，我國各地的報道顯示［8-11］，北京57.10%，湖南44.45%，福建36.10%。本研究中，HPV感染率為30.80%，與其他地區(qū)研究有一定差異，這可能是HPV分布的地域差異性，也可能不同研究者選擇的目標人群和研究方法不同引起的。從各年齡段HPV感染情況看，≤25、≥46 歲年齡段顯著高于其他年齡段，不同年齡段HPV感染率呈現(xiàn)出“U”形曲線，與聶芳妹等［9］報道相似。

HPV亞型的分布具有地域差異性，不同亞型的致病能力不同。因此，對HPV篩查的分型顯得至關(guān)重要。本研究中，高危型HPV的感染率為61.67%，低危型感染率為21.23%，高低危亞型混合感染率為17.10%，顯示重慶地區(qū)HPV的感染以高危型感染為主。高危型HPV感染率排在前6位的為HPV58（10.34%）、HPV16（10.24%）、HPV52（10.09%）、HPV56（6.49%）、HPV33（5.66%）、HPV18（4.56%），低危型感染率前3位的為HPV6（10.70%）、HPV43（7.31%）、HPV11（4.60%），這一結(jié)果與本地區(qū)的其他報道［9，12］有一定程度程度的差異，究其原因，可能是HPV亞型分布在重慶地區(qū)的一個真實表現(xiàn)，也有可能是研究者所選的研究對象、研究標本數(shù)量以及研究方法之間存在一定程度的差異引起的。

重慶地區(qū)不同年齡HPV亞型單重感染和多重感染構(gòu)成比中，單重感染是HPV感染的主要形式，這可能是HPV感染的一個特點，與國內(nèi)報道一致［9-11］。各年齡段多重感染患者中，以二重感染為主，≤25 歲年齡段的三重和四重感染率顯著高于其他年齡段。在45 歲之前，多重感染率的分布呈下降趨勢，46 歲以后多重感染有所回升，這可能與女性青春期和更年期機體內(nèi)環(huán)境變化有關(guān)，這2 個時期機體免疫力和激素水平都有所變化，可能會造成對HPV病毒的免疫力下降。提示，在進行HPV篩查時，應(yīng)重視這2 個年齡段的人群。

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