李宗芳，張振光，龔霞蓉，田 偉，戴敏方，劉 流

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院磁共振室，昆明650032；2.云南省第一人民醫(yī)院磁共振室，昆明650032；3.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科，昆明650032）

研究表明面神經(jīng)高位損傷可導(dǎo)致面神經(jīng)元的顯著凋亡［1-5］。以往研究凋亡采用的探測方法都為體外檢測法，這些方法通常需要處死動物，而對人體內(nèi)器官組織的凋亡研究則具有創(chuàng)傷性。作為一種無創(chuàng)性研究活體組織器官代謝物水平變化的影像學(xué)方法，質(zhì)子磁共振波譜成像（proton magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS）為面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的無創(chuàng)性檢測帶來了希望。本研究通過對正常大鼠和面神經(jīng)高位損傷大鼠模型行面神經(jīng)核區(qū)1H-MRS成像，并對照組織病理學(xué)改變，以期探討1H-MRS在面神經(jīng)高位損傷后面神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的無創(chuàng)性檢測中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠40只，對照組20只，實驗組20只，體質(zhì)量（200±10）g，由昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。分籠喂養(yǎng)于光照、黑暗均為12 h的恒溫環(huán)境，自由攝食和飲水。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 大鼠面神經(jīng)高位損傷模型的建立 參照文獻(xiàn)［4-5］，建立雙側(cè)面神經(jīng)高位損傷模型，術(shù)后3 周行1H-MRS。具體方法：術(shù)前6 h 禁食，稱體質(zhì)量后后經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛（1 m L／100 g）進(jìn)行全麻。麻醉生效后取俯臥位固定，耳后溝縱行切開皮膚約2 cm，于腮腺后上緣暴露面神經(jīng)主干，沿主干向上稍追蹤，在莖乳孔根部松解面神經(jīng)并輕拉，使其被牽拉出約3 mm后切斷，造成面神經(jīng)高位損傷，斷端腦側(cè)自然回縮入莖乳孔。說明：本方法是雙側(cè)面神經(jīng)高位切斷。因為目前3.0T MRS雖在大鼠大腦可以做到單側(cè)采集并自體對照，但在橋腦水平，由于橋腦本身體積較小且MRS 最小感興趣區(qū)有限，在兼顧譜線質(zhì)量的情況下，能達(dá)到的最小感興趣區(qū)中橋腦雙側(cè)都會被包含在內(nèi)，所以目前還做不到單側(cè)采集，只有雙側(cè)高位切斷面神經(jīng)，并與正常大鼠進(jìn)行對比。本文中波譜采集的感興趣區(qū)可以從圖1A、B 中左上角的感興趣區(qū)定位圖中看到。

1.3 面神經(jīng)麻痹評價 面癱的觀察包括瞬目反射和觸須運(yùn)動［6］。瞬目反射的觀察是用5 m L注射器18 號針頭距離鼠眼3 cm瞬間吹風(fēng)2 mL，比較雙側(cè)眨眼的速度和幅度進(jìn)行評分：0分為雙側(cè)正常且對稱、1 分為減弱或延緩、2 分為消失。觸須運(yùn)動的觀察是通過比較雙側(cè)觸須拂動的程度進(jìn)行評分：0 分為雙側(cè)拂動正常且對稱、1 分為觸須拂動減弱、2 分為消失。將2 項指標(biāo)的評分相加進(jìn)行面癱的鑒定和評價（0，1 分為無面癱；2，3分為不完全面癱；4 分為完全性面癱）。

表1 對照組和實驗組面神經(jīng)核區(qū)的1H-MRS 代謝物值的比較（±s，n＝20）

表1 對照組和實驗組面神經(jīng)核區(qū)的1H-MRS 代謝物值的比較（±s，n＝20）

組別 NAA NAA／Cr Cho Cho／Cr對照組 10173．18 ±1500．331．27 ±0．146035．76 ±1357．420．76±0．19實驗組 7840．00 ±2671．460．94 ±0．335514．50 ±1801．510．66 ±0．22 t 3．1593．7820．9621．418 P 0．0030．0010．3430．165

1.4 MRI 及1H-MRS 掃描 采用GE 3.0T超導(dǎo)M R掃描儀（Signa HDxt）及大鼠專用動物線圈。大鼠經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛（1 mL／100 g）麻醉后，俯臥位固定。

常規(guī)MRI 掃描：采用快速自旋回波（fast spin echo，F(xiàn)SE）的T2WI 序列，以橋腦為中心進(jìn)行軸位、矢位及冠位的掃描，目的是為1 H-MRS掃描提供定位像。掃描參數(shù)為：TR／TE：1140 ms／110 ms，視野：8.0 cm ×5.6cm，矩陣：320 ×256，激勵次數(shù)：3，層厚／間隔：2.0 mm／0.3 mm，回波鏈：10。

1 H-MRS 掃描：依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［7］，以第四腦室尖所對橋腦平面為中心（面神經(jīng)核團(tuán)最大層面），選擇1 感興趣區(qū)，取感興趣區(qū)時盡量避開周圍骨質(zhì)、血管及腦脊液等，并在其周圍使用選擇性飽和帶。用點(diǎn)分辨波譜序列（point-resolved surface coil spectroscopy，PRESS），對所選擇的感興趣區(qū)自動完成體素內(nèi)勻場、抑水，達(dá)到理想標(biāo)準(zhǔn)后開始1H-MRS 掃描。PRESS 序列參數(shù)：TR／TE：1000ms／144ms，矩陣：12 ×12，激勵次數(shù)：5，F(xiàn)OV：10 cm，掃描時間12 分4 秒。原始數(shù)據(jù)傳入工作站后使用Functool 4.5.5 軟件進(jìn)行處理。在重建的波譜圖上，獲得波譜分析軟件自動計算出的各代謝物的值，包括N-乙酰天門冬氨酸（N-acetylaspartate，NAA）、膽堿（choline，Cho）、Cho，并以Cr 值為標(biāo)準(zhǔn)，計算NAA／Cr 和Cho／Cr 的值。

1.5 對照組與實驗組組大鼠面神經(jīng)核的蘇木素-伊紅（HE）、甲胺苯藍(lán)（TB）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP 原位切口末端標(biāo)記（TUNEL）染色 于MR檢查后取對照組2 只與實驗組4 只大鼠行灌注、取材和切片。切片時取面神經(jīng)根與副神經(jīng)根之間腦干，依據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［7］定位面神經(jīng)核位置，然后以5μm層厚連續(xù)切片，每5 張取1 張切片進(jìn)行貼片。共收集3 套切片，分別行HE、TB 和TUNEL 染色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，2 組大鼠面神經(jīng)核團(tuán)腦組織的NAA、Cho、NAA／Cr 及Cho／Cr 指標(biāo)之間的比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)t 檢驗進(jìn)行統(tǒng)計處理，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 面神經(jīng)損傷大鼠模型的行為學(xué)觀察 術(shù)后所有動物進(jìn)食、活動正常。術(shù)后1～3 周雙側(cè)觸須均集中伸直并向后伸展，完全不能抖動，瞬目反射消失，呈現(xiàn)完全性面癱，證實造模成功。

2.2 1H-MRS 檢測結(jié)果 實驗組NAA、NAA／Cr 較對照組降低且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Cho 及Cho／Cr 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1，圖1、2。

圖1 2組1H-MRS 的感興趣區(qū)定位圖及波譜圖

圖2 2組面神經(jīng)核病理學(xué)染色圖（×100）

2.3 2組大鼠面神經(jīng)核的HE、TB 和TUNEL 染色 對照組，HE 染色：正常面神經(jīng)元胞核呈淡紫色，細(xì)胞質(zhì)為深紫色，神經(jīng)元周圍分布著膠質(zhì)細(xì)胞。TB 染色：與HE 染色比較，由于膠質(zhì)細(xì)胞染色淺淡，面神經(jīng)元染色更為明顯；高倍鏡下正常面神經(jīng)元胞核呈淡藍(lán)色，核仁明顯、居中呈紫藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)中尼氏體染色均勻呈紫藍(lán)色。TUNEL染色：正常面神經(jīng)元胞核呈淡棕色，核仁和細(xì)胞質(zhì)均為淡綠色，TUNEL陽性細(xì)胞為棕褐色，即凋亡細(xì)胞。由圖可知對照組大鼠面神經(jīng)核中沒有或偶見單個凋亡細(xì)胞，見圖2A、B、C。實驗組，HE染色：大量神經(jīng)元表現(xiàn)為細(xì)胞固縮，胞體收縮，呈類三角形，胞核收縮呈不規(guī)則形狀。沒有發(fā)現(xiàn)紅色神經(jīng)元、鬼影細(xì)胞、衛(wèi)星現(xiàn)象等神經(jīng)元壞死的特異性改變，因此可以排除細(xì)胞壞死。TB 染色：大量神經(jīng)元表現(xiàn)為細(xì)胞固縮，胞體收縮，呈類三角形，胞核收縮呈不規(guī)則形狀。TUNEL 染色：面神經(jīng)核中見大量陽性細(xì)胞，見圖2A1、B1、C1。

3 討 論

3.1 面神經(jīng)高位損傷后面神經(jīng)元的凋亡 文獻(xiàn)報道，當(dāng)面神經(jīng)高位損傷后其胞體從靶器官獲取的神經(jīng)營養(yǎng)因子減少，出現(xiàn)形態(tài)改變，并不可避免地引起一定數(shù)量的神經(jīng)元細(xì)胞死亡，且其死亡方式以凋亡為主。Dai 等［2］、方澤強(qiáng)等［3］對大鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)元的變化進(jìn)行了研究，認(rèn)為面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核內(nèi)的神經(jīng)元在15 d 達(dá)到凋亡高峰。Park 等［4］對小鼠面神經(jīng)高位損傷4 周時面神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量進(jìn)行了計數(shù)，研究認(rèn)為損傷側(cè)的面神經(jīng)核內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量僅有正常側(cè)的10%。而本實驗前期研究認(rèn)為，面神經(jīng)高位損傷后面神經(jīng)核內(nèi)的神經(jīng)元在第3 周時較第2 周明顯［5］，所以本實驗選擇在造模后3 周行1H-MRS。

3.2 MR掃描儀在大鼠1 H-MRS 研究方面的應(yīng)用 MRS 是1 種利用化學(xué)位移現(xiàn)象對特定原子核及化合物進(jìn)行定量分析的功能性成像技術(shù)，在臨床癥狀出現(xiàn)之前即可早期無創(chuàng)傷性地測量活體腦組織內(nèi)化合物的代謝變化。1H-MRS對NAA、Cho、Cr 這3 種化合物濃度的測量具有很好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，可通過這些化合物濃度的變化反映腦內(nèi)一些疾病的病理變化。由于大鼠的體質(zhì)量相對于人體很小，需要更高的空間分辨率及信噪比，所以大鼠腦的1 H-MRS 在以往多使用4.7T及其以上場強(qiáng)的非臨床型MR掃描儀進(jìn)行研究，國內(nèi)外已有很多報導(dǎo)［8-11］。但隨著近年來1.5T及3.0T MR掃描儀在臨 床 上的推廣及軟硬件的提高，越來越多的研究者嘗試在臨床型MR掃描儀上進(jìn)行大鼠動物模型的1H-MRS 研究。Dogan 等［12］在1.5TMR掃描儀上用1 H-MRS 技術(shù)來研究3G手機(jī)的電磁輻射對大鼠大腦的影響。Leib 等［13］在2.34T MR掃描儀上用1H-MRS 技術(shù)來研究丙戊酸鹽體內(nèi)注射后活體大鼠腦內(nèi)丙戊酸鹽的檢測。Ma 等［14］用1H-MRS 技術(shù)來研究在體和離體偏頭痛大鼠模型腦內(nèi)代謝物濃度的變化，其中在體研究使用3.0T MR 掃描儀，離體研究使用14.7T MR掃描儀，二者的結(jié)果一致。上述研究證明在臨床型MR儀上用1H-MRS 技術(shù)無創(chuàng)性檢測一些大鼠模型腦內(nèi)代謝物的變化是可行的，所以本實驗嘗試用3.0T MR掃描儀來研究1H-MRS 在面神經(jīng)高位損傷后面神經(jīng)元凋亡的無創(chuàng)性檢測中的應(yīng)用價值，以期為將來的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

3.3 NAA峰值的變化及意義 N A A是正常波譜中的最高峰，位于2.02 ppm處。NAA主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中出現(xiàn)，而不出現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或者是非神經(jīng)細(xì)胞組織中，是神經(jīng)元及其附屬物的特異性標(biāo)記物，被稱為神經(jīng)元的內(nèi)標(biāo)記物。NAA的含量可反映腦內(nèi)神經(jīng)元的數(shù)量、功能和神經(jīng)元的完整性，在神經(jīng)元喪失或者是受損時，其濃度下降。在1H-MRS 中，NAA含量或與其他代謝物的比值的減低，可作為神經(jīng)元數(shù)量缺少和功能障礙的最佳指標(biāo)［15］。Woo等［10］應(yīng)用1 H-MRS 技術(shù)研究大鼠腦缺血模型腦內(nèi)代謝物的變化，發(fā)現(xiàn)NAA／Cr 值在缺血再灌注后9h 時出現(xiàn)降低，同時TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯增多。趙光明等［16］對三叉神經(jīng)慢性疼痛的大鼠模型雙側(cè)丘腦進(jìn)行1H-MRS 檢測，慢性疼痛致模型組丘腦區(qū)NAA／Cr 值較假手術(shù)組減少，表明1H-MRS 可以檢測出慢性疼痛狀態(tài)下丘腦神經(jīng)元的受損情況。本實驗實驗組NAA、NAA／Cr 值較對照組降低，提示實驗組面神經(jīng)核區(qū)神經(jīng)元的含量較對照組減少，同時行為學(xué)檢測顯示大鼠呈完全性面癱，病理學(xué)顯示面神經(jīng)核中大量TUNEL陽性細(xì)胞，表明1HMRS 的檢測結(jié)果與行為學(xué)表現(xiàn)和病理學(xué)結(jié)果一致，提示1HMRS 可以作為一種無創(chuàng)性評價面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的方法。

3.4 Cho 峰值的變化及意義 Cho 的波峰位于3.2 ppm處，是細(xì)胞膜磷脂代謝的主要成分之一，反映細(xì)胞膜的更新。Cho反映腦內(nèi)總膽堿的儲藏量，包括游離膽堿、磷酸膽堿、磷脂酰膽堿和磷酸甘油膽堿等。Cho 與細(xì)胞膜磷脂的分解和合成有關(guān)，可反映細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和神經(jīng)膠質(zhì)的增生。Cho 峰增高提示細(xì)胞分裂增殖活躍，以及細(xì)胞膜代謝異常增高［17］。本實驗中對照組與實驗組Cho、Cho／Cr 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這可能是因為面神經(jīng)核區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的同時，有大量的膠質(zhì)細(xì)胞增生，抵消了神經(jīng)元細(xì)胞凋亡引起的Cho 量的減少，從而導(dǎo)致Cho、Cho／Cr 無明顯變化［3］。關(guān)于Cho／Cr 的變化，目前未有明確的理論解釋，尚需進(jìn)一步研究探討。

綜上，本研究應(yīng)用1H-MRS 技術(shù)在大鼠活體上無創(chuàng)檢測了面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核區(qū)NAA、Cho、Cr 等物質(zhì)的代謝改變，并與行為學(xué)表現(xiàn)及病理學(xué)檢測結(jié)果一致，提示1H-MRS 可以作為1 種無創(chuàng)性評價面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的方法，為將來的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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