張 劍，吳 敏，張自森，王利娟，張紅巧，師廣勇，巴 楠，閆 琳，鄭曉珂，邢 鑫

（鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院腫瘤科 450052）

結(jié)腸癌是常見的消化系惡性腫瘤，其在歐美國(guó)家發(fā)病率較高，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率較低，但近年來，隨著生活水平及飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率明顯升高。SLP-2基因?qū)儆趕tomatin基因家族成員，是2001年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)基因［1］，近年來的研究顯示，SLP-2 在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，可能是一個(gè)新的腫瘤相關(guān)基因［2-6］。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)SLP-2 在人結(jié)腸癌配對(duì)組織中的表達(dá)，并通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116 中SLP-2 的表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCT-116 細(xì)胞中SLP-2 的表達(dá)情況，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HCT-116 細(xì)胞增殖及周期的變化，旨在探討結(jié)腸癌中SLP-2 的表達(dá)特點(diǎn)及SLP-2 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 結(jié)腸癌組織及距離癌組織邊緣大于5 c m的癌旁正常結(jié)腸組織為鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2010年1月至2011年1月手術(shù)切除結(jié)腸癌標(biāo)本，共50例，其中男27例，女23例，年齡40～72 歲，中位年齡63 歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為結(jié)腸癌，術(shù)前未接受過放、化療。臨床分期按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（AJCC）2010年第7 版，其中早期結(jié)腸癌（Ⅰ＋Ⅱ期）13例，晚期結(jié)腸癌（Ⅲ＋Ⅳ期）37例。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116 購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。用含抗菌藥物和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3～5 d傳代1 次。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建的SLP-2s i RNA序列正向引物：5′-UGC UGC CUG AUU UAU CUG UUC AGC C-3′，反向引物：5′-GGC UGA ACA GAU AAA UCA GGC AGC A-3′由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。細(xì)胞按5 ×104／孔接種于24 孔板上，參考LipofectamineTM2000說明書，50μL的RPMI-1640 無 血 清 培養(yǎng)液中加入20 pmol SLP-2 siRNA混勻，Lipofectamin 試劑，用50μL 無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液稀釋1μL Lipofectamin 試劑，混勻。將稀釋好的SLP-2 siRNA和Lipofectamin試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min，以形成SLP-2 siRNA／Lipofectamin 復(fù)合物；將以上混合液加到含有細(xì)胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中，在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育24 h 后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）和空白對(duì)照組（不轉(zhuǎn)染siRNA）。

1.4 RNAi 有效時(shí)間點(diǎn)的篩選 分別于轉(zhuǎn)染后24、48 和72 h收集細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR 及Wester blot 檢測(cè)，比較上述3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的siRNA干擾效果的差異，從中找到最為有效的時(shí)間點(diǎn)。SLP-2 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度：500 bp，上游引物5′-CTG GAG CCT GGT TTG AAC AT-3′；下游引物5′-AGG ATC TGG GCC TGT TTC TT-3′。內(nèi)參β-actin 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度242 bp，上游引物5′-ACA CTG TGC CCA TCT ACG ACC-3′；下游引物5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT AGA-3′。引物由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體系：2 ×Taq PCR Master Mix 12.5μL，SLP-2 及內(nèi)參上、下游引物各1μL，cDNA 2μL，dd H2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)條件，預(yù)變性94 ℃，5 min；變性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，50 s，30 循環(huán)；延伸72 ℃，7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條帶圖像凝膠成像儀掃描，以SLP-2 與β-actin 的灰度值的比值表示SLP-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。SLP-2 單克隆抗體和抗β-actin 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。提取HCT-116細(xì)胞總蛋白，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，穩(wěn)流冰浴電轉(zhuǎn)膜，分別與抗辣根過氧化物酶連接的二抗（美國(guó)Santa Cruz 公司）孵育，DAB 顯色拍照。

1.2 免疫組織化學(xué) 鼠抗人SLP-2 單克隆抗體稀釋度為1∶200，購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自邁新公司。用已知陽(yáng)性片（子宮內(nèi)膜癌切片，為公司提供）作陽(yáng)性對(duì)照用PBS 代替一抗作陰性對(duì)照。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［7］，由兩位高年資病理醫(yī)師在雙盲條件下進(jìn)行評(píng)分，每張切片根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及陽(yáng)性細(xì)胞染色程度進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)染色程度評(píng)分由每張切片的大多數(shù)細(xì)胞染色情況決定，0 分：無著色，1分：淺黃色為，2 分：黃色，3 分：棕黃色。陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評(píng)分，0 分：沒有陽(yáng)性細(xì)胞，1 分：1%～25%陽(yáng)性，2 分：26%～50%陽(yáng)性，3分：51%～75%陽(yáng)性，4 分：＞75%陽(yáng)性。二者分?jǐn)?shù)相乘為總分，≥8 分為高表達(dá)，＜8 分為陰性或低表達(dá)。

1.5 噻唑藍(lán)（MTT）試驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h 轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的HCT-116 細(xì)胞，每孔加入200μL 5 mg／mL MTT，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。棄MTT，每孔加入200μL 二甲基亞砜（DMSO），酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（OD）值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA 48 h 后轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組HCT-116 細(xì)胞，參考文獻(xiàn)［8］處理后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)中每組各設(shè)3 個(gè)平行對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示，計(jì)數(shù)資料采用率表示，結(jié)腸癌配對(duì)組織中SLP-2 蛋白表達(dá)的比較采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)染SLP siRNA后各組HCT-116 細(xì)胞中SLP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)量以及轉(zhuǎn)染SLP siRNA后各組HCT-116 細(xì)胞周期和增殖能力的比較采用方差分析，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SLP-2 蛋白在結(jié)腸癌及癌旁正常結(jié)腸組織的表達(dá)SLP-2在癌旁正常結(jié)腸組織中多為陰性或低表達(dá)，高表達(dá)例數(shù)為11例（22.0%），在結(jié)腸癌組織中則多呈高表達(dá)，高表達(dá)例數(shù)分別為35例（70.0%）。二者的高表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝23.188，P＝0.000），見圖1。

2.2 SLP-2 蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系 見表1。

表1 SLP-2 的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（n）

圖2 轉(zhuǎn)染48 h 后各組HCT-116 細(xì)胞中SLP-2 m RNA的表達(dá)

2.3 siRNA的轉(zhuǎn)染及有效時(shí)間點(diǎn)的確定 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA序列后，HCT-116 目的基因SLP-2 的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢(shì)。從轉(zhuǎn)染后24 h 開始，SLP-2 基因的表達(dá)就有所下降，轉(zhuǎn)染后48 h 表達(dá)量最低。72hSLP-2 基因表達(dá)量有所回升，但仍維持在較低水平。因轉(zhuǎn)染后48 h 后表達(dá)抑制率最高，表達(dá)降低幅度最大，因此該時(shí)間點(diǎn)被選做轉(zhuǎn)染有效時(shí)間點(diǎn)。轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組SLP-2 mRNA表達(dá)水平為0.55±0.26，空白對(duì)照組為1.42±0.31，陰性對(duì)照組為1.35±0.38，3 者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝6.764，P＝0.029），見圖2。轉(zhuǎn)染48 h 后，實(shí)驗(yàn)組SLP-2 蛋白表達(dá)水平為0.61±0.30，空白對(duì)照組為1.38±0.42，陰性對(duì)照組為1.47±0.35，3 者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝5.171，P＜0.05），見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染48 h 后各組HCT-116 細(xì)胞中SLP-2 蛋白的表達(dá)

2.4 轉(zhuǎn)染SLP-2 s i RNA后HCT-116細(xì)胞增殖力的變化 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，增殖力下降（P＜0.05），見表2。

2.5 轉(zhuǎn)染SLP-2 s i RNA后HCT-116 細(xì)胞周期的變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3，圖4。

表2 SLP-2 siRNA對(duì)HCT-116 細(xì)胞增殖的 影響（n＝3，±s）

表2 SLP-2 siRNA對(duì)HCT-116 細(xì)胞增殖的 影響（n＝3，±s）

a：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組比較。

組別 轉(zhuǎn)染后24 h 轉(zhuǎn)染后48 h 轉(zhuǎn)染后72 h 轉(zhuǎn)染后96 h實(shí)驗(yàn)組 0.331±0.0280.438±0.0390.636±0.1150.857±0.045陰性對(duì)照組 0.353±0.0470.604±0.035a 1.010±0.097a 1.459±0.400a空白對(duì)照組 0.341±0.0290.663±0.067a 1.061±0.185a 1.747±0.101a F 0.27917.0058.52510.825 P 0.7660.0030.0180.010

表3 3 組HCT-116 細(xì)胞的細(xì)胞周期變化（n＝3，±s，%）

表3 3 組HCT-116 細(xì)胞的細(xì)胞周期變化（n＝3，±s，%）

a：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)組比較。

組別 G1期 S期 G2／M期SLP-2 siRNA轉(zhuǎn)染組69.8±2.418.3±2.712.0±1.6陰性對(duì)照組 53.6±4.1a 30.9±3.6a 15.3±2.1空白對(duì)照組 57.5±3.7a 28.7±5.3a 13.5±3.3

圖4 SLP-2 siRNA對(duì)HCT-116 細(xì)胞周期的影響

3 討 論

SLP-2 是2000年由美國(guó)耶魯大學(xué)病理科首次發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)新基因，屬于stomatin基因超家族。人SLP-2基因定位于9p13.1，編碼長(zhǎng)約1500 bp 的mRNA，其編碼的蛋白含357 個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為3.9 ×103。SLP-2 蛋白是一種細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，可能作為外周膜蛋白起作用，調(diào)控離子通道和脂筏結(jié)構(gòu)［1，8］。SLP-2 蛋白還存在于細(xì)胞線粒體中，是一種線粒體相關(guān)蛋白，可能參與調(diào)節(jié)與其結(jié)合的線粒體膜相關(guān)蛋白的穩(wěn)定性，影響ATP 的合成［7，9］。

近年 來的研究顯示，SLP-2基因在食管鱗癌［7，10］、肺 癌［2］、子宮內(nèi)膜癌［4］、乳腺癌［5，11］、胃癌［3，6］等惡性腫瘤中高表達(dá)。且SLP-2 反義基因可抑制某些惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡，推測(cè)SLP-2 可能促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡，并參與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［4，7，10］。這些研究表明，SLP-2 可能是一個(gè)新的惡性腫瘤相關(guān)基因。但目前有關(guān)SLP-2 在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及作用機(jī)制的研究較少。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)SLP-2 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)升高，通過分析結(jié)腸癌患者的臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)在較晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中SLP-2 表達(dá)升高更為明顯。為進(jìn)一步研究SLP-2 在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題組設(shè)計(jì)合成SLP-2 siRNA，將其轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，采用MTT及流式細(xì)胞儀檢測(cè)HCT-116 細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA后，HCT-116 細(xì)胞的增殖活性下降，G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少。提示SLP-2 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。

SLP-2 在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確，推測(cè)可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路及線粒體能量代謝有關(guān)。SLP-2蛋白作為一種膜相關(guān)蛋白，與細(xì)胞信號(hào)通路密切相關(guān)，可能通過對(duì)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有文獻(xiàn)報(bào)道，SLP-2 蛋白可能通過與Rho 家族蛋白的相互作用，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力［12］。祁代華等［13］的研究也顯示，結(jié)直腸癌組織中SLP-2 與Rho 家族CDC42 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，且與結(jié)直腸癌的Dukes 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA降低Hela 細(xì)胞中SLP-2 的表達(dá)，可引起線粒體膜電勢(shì)的降低［9］；轉(zhuǎn)染SLP-2 siRNA降低食管癌KYSE150 細(xì)胞中SLP-2 表達(dá)后，細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)和ATP水平均降低，同時(shí)伴細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和增殖能力減弱［7］；推測(cè)SLP-2可能通過影響細(xì)胞的能量代謝參與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。目前對(duì)SLP-2 的研究不多，對(duì)SLP-2 在惡性腫瘤中作用機(jī)制的研究仍處于起步階段，有待進(jìn)一步深入探索。

本研究發(fā)現(xiàn)SLP-2 在結(jié)腸癌中表達(dá)升高，SLP-2 基因沉默可使HCT-116 細(xì)胞被阻滯在G1期，增殖活性降低。該研究結(jié)果對(duì)闡明結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制及尋找新的結(jié)腸癌治療分子靶點(diǎn)具有一定意義。

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