宋蜀伶,潘鑫艷,王 力

HE制片技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化初步探討

宋蜀伶,潘鑫艷,王 力

HE染色；制片；標(biāo)準(zhǔn)化；管理

隨著科技的發(fā)展,許多新技術(shù)和新方法源源不斷地融入到傳統(tǒng)的病理技術(shù)當(dāng)中,如分子病理技術(shù)、組織芯片、圖像分析技術(shù)、顯微切割和遠(yuǎn)程病理技術(shù)等。但是,HE常規(guī)制片技術(shù)作為病理學(xué)的重要組成部分,仍然是臨床病理診斷工作中最基本、最重要的技術(shù)手段,廣泛地應(yīng)用于臨床、教學(xué)和科研工作中。HE制片技術(shù)的發(fā)展有100多年的歷史,HE切片診斷工作在一些大中醫(yī)院相繼展開,有關(guān)疾病診斷方面的WHO標(biāo)準(zhǔn)日趨成熟,但在HE制片技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化方面,目前全球還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。各家醫(yī)療機(jī)構(gòu)HE制片方法五花八門,制片質(zhì)量參差不齊,嚴(yán)重影響了病理診斷的準(zhǔn)確率和及時(shí)率。因此,加強(qiáng)醫(yī)療機(jī)構(gòu)HE制片技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化管理,對(duì)提升醫(yī)院的整體醫(yī)療水平具有重要意義。筆者參考有關(guān)病理技術(shù)的相關(guān)報(bào)道,結(jié)合多年的工作經(jīng)驗(yàn),就HE制片過程中的主要環(huán)節(jié),對(duì)HE制片技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)行了初步探討。

1 固定

組織固定是HE制片的第一步。組織離體后應(yīng)立即固定,組織固定時(shí)間因固定液種類、組織種類、大小、質(zhì)地、有無包膜等而異。組織固定溫度一般控制在37 ℃以下,組織固定溫度越高,固定時(shí)間越短。對(duì)于一般組織,若材塊體積在2 cm×2 cm×0.5 cm范圍內(nèi),可按固定液每小時(shí)滲透組織2 mm估算固定時(shí)間。對(duì)于較大的標(biāo)本,應(yīng)沿最大剖面每隔0.5～2.0 cm切開,分開或中間夾隔離物固定?？涨慌K器應(yīng)沿長(zhǎng)軸剪開,平鋪固定于支持物上,再放入固定液中固定。對(duì)于有包膜、類球形組織,應(yīng)將組織切成片狀,有利于快速固定。

固定液的選擇應(yīng)根據(jù)組織的成分而定,在目前還沒有實(shí)現(xiàn)組織個(gè)性化固定的情況下,提倡用10%中性福爾馬林固定組織。固定液體積應(yīng)為所固定組織的10～20倍。

2 取材

應(yīng)根據(jù)組織的構(gòu)成、病變組織的范圍及觀察目的等確定取材的大小和數(shù)量,直徑<0.5 cm的標(biāo)本,要用濾紙或拭鏡紙等包裹,并在組織上滴加1～2滴伊紅染液以便包埋和切片；復(fù)雜標(biāo)本要多部位取材,上、下、左、右、中間、瘤組織與正常組織的交界均應(yīng)取材,所取組織塊應(yīng)大小適中、厚薄均勻、形狀規(guī)則,取材體積不應(yīng)大于1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm。

取材時(shí)要保持取材刀的鋒利,切割組織時(shí)避免用力下壓取材刀或來回拖拉取材刀,用鑷子夾取組織時(shí)動(dòng)作要輕柔,以免組織擠壓嚴(yán)重而發(fā)生變性影響診斷。取材要注意組織或器官的連續(xù)性或完整性,皮膚要帶有表皮和真皮,腸壁和胃壁要有黏膜和肌層,腎臟要有皮質(zhì)和髓質(zhì)等[1]。對(duì)于骨組織或鈣化組織,待組織脫鈣充分后(細(xì)針無阻力扎透)即可取材,用流水沖洗>0.5 h或浸入10%碳酸鈉溶解0.5 h以除去組織間殘留酸液,方可進(jìn)入下一程序。取材時(shí)要剔除組織周圍無診斷意義的脂肪及標(biāo)本中殘留的手術(shù)線等異物,脂肪過多,易引起組織脫水、浸蠟不充分,導(dǎo)致切片困難。取材時(shí)大小淋巴結(jié)均應(yīng)剖開,避免因其包膜阻隔引起脫水和浸蠟不良。

3 脫水

脫水時(shí)間對(duì)HE質(zhì)量至關(guān)重要,脫水時(shí)間除與組織的大小、種類和質(zhì)地等直接相關(guān)外,還與脫水劑的質(zhì)量及環(huán)境溫度、濕度等有關(guān)。一般來說,對(duì)于相同或相近的組織,小組織比大組織的脫水時(shí)間要短,小個(gè)體比大個(gè)體的脫水時(shí)間要短。但現(xiàn)實(shí)情況是,大多數(shù)醫(yī)療機(jī)構(gòu)都無法做到大小標(biāo)本分別或分開脫水,而是將各種標(biāo)本混裝在一個(gè)或幾個(gè)脫水機(jī)中,以相同的程序完成脫水。這樣就容易造成小標(biāo)本過度脫水,引起組織過脆、過硬,切片時(shí)易破碎及跳刀,不能切出完整蠟?zāi)?；大?biāo)本脫水不充分,造成透明欠佳,浸蠟不好,組織柔軟無法制片。

因此,大小標(biāo)本應(yīng)分開脫水。另外還要熟悉各種組織的脫水特性,肝、脾、腦、腎、淋巴結(jié)等組織脫水時(shí)間要短；乳腺、網(wǎng)膜、皮膚等含脂肪多的標(biāo)本要適當(dāng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間。對(duì)于不能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)脫水的醫(yī)療單位,還要注意脫水劑的溫度及空氣濕度對(duì)脫水的影響,溫度高有利于組織脫水,溫度過低可延長(zhǎng)組織脫水時(shí)間,雨季或潮濕季節(jié)也要適當(dāng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間。脫水劑要定期或定量更換,應(yīng)根據(jù)脫水劑的容量和每天標(biāo)本的數(shù)量,計(jì)算出更換脫水劑的時(shí)間。

透明時(shí)間因組織的大小、種類和質(zhì)地而異,此外,還與透明劑質(zhì)量及試劑溫度等有關(guān)。提高透明溫度可縮短透明時(shí)間,但當(dāng)溫度高于活體體溫時(shí),容易造成組織發(fā)脆。透明時(shí)間過長(zhǎng)或透過溫度過高都會(huì)引起組織變脆變硬,造成后制片困難。透明時(shí)間控制在90 min以內(nèi),透明溫度不要超過40 ℃。應(yīng)定期更換透明試劑,保證透明質(zhì)量。

4 浸蠟

浸蠟一般要經(jīng)多級(jí)步驟才能完成,第一級(jí)石蠟要用軟蠟,后面幾級(jí)用硬蠟。浸蠟溫度不要太高,一般高于所用石蠟溫度1～2 ℃為宜。浸蠟所用石蠟質(zhì)量要有保證,不要含有過多雜質(zhì),雜質(zhì)過多會(huì)污染切片,損害切片刀片,造成切片劃痕增多,影響制片質(zhì)量。對(duì)于質(zhì)量不定的石蠟,購(gòu)入后可用水煮沸以盡量去除雜質(zhì)。

浸蠟溫度和時(shí)間對(duì)浸蠟過程影響較大,溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng),組織會(huì)收縮變硬變脆；溫度過低或時(shí)間過短,組織浸蠟不充分,組織缺乏硬度,不利于制片。浸蠟溫度一般在62 ℃左右,浸蠟時(shí)間不要超過3 h。

5 包埋

包埋所用石蠟應(yīng)和最后一級(jí)浸蠟的石蠟相同,包埋的蠟溫應(yīng)高于石蠟熔點(diǎn)2～4 ℃。一般來說,組織的硬度最好能和包埋時(shí)所用石蠟的硬度一致,便于切片。包埋時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的特性和診斷需要將組織按一定規(guī)律排列。一般將組織的最大面或病灶面朝下包埋,不平整的組織要用鑷子輕輕壓平以保持組織切面的完整,但有時(shí)病灶面比組織的最大面更有意義；大小不一的組織同時(shí)包埋在一個(gè)蠟塊中時(shí),按組織從大到小依次包埋,并確保每個(gè)組織的最大面在一個(gè)平面上；管腔組織、乳頭狀組織、皮膚及囊壁等組織要豎立包埋,以保證鏡檢時(shí)能觀察到各層組織結(jié)構(gòu)。

6 切片

切片是HE制片質(zhì)量較為關(guān)鍵的一環(huán),切片前的蠟塊預(yù)處理對(duì)制片質(zhì)量影響較大[1]。我科在修片后用冰水混合物處理組織,與常規(guī)冷凍處理蠟塊方法相比,對(duì)那些脫水或透明過度、脫水或浸蠟不足的組織,前者制片效果明顯優(yōu)于后者。切片時(shí)要均勻用力,用力過大、速度過快都會(huì)導(dǎo)致切片厚薄不均。軟的組織切片速度稍慢；較硬的組織切片速度稍快。切片時(shí)還應(yīng)注意蠟塊中組織結(jié)構(gòu)的層次和方向,一般來說,組織中纖維、肌肉等的走向應(yīng)與切片刀平行,質(zhì)地較硬的部分應(yīng)放在上面,如皮膚的表皮、腫塊的包膜、胃腸道的漿膜等,這樣可以減少組織破碎、斷裂、厚薄不均等現(xiàn)象。

對(duì)于長(zhǎng)徑≤3 mm的細(xì)小組織,如大部分內(nèi)鏡、穿刺標(biāo)本,組織切面數(shù)要在8個(gè)以上。對(duì)于脫鈣組織、鈣化組織和硬化組織等,切片前要提前挑出,放在最后切片,以延長(zhǎng)切片刀的使用壽命。切面厚度控制在3～6 μm。對(duì)于細(xì)胞成分較多的組織,如淋巴結(jié)等,切得要薄一些,細(xì)胞成分較少的組織,如脂肪組織等,切得稍厚一些。

7 撈片

撈片時(shí)應(yīng)注意“定位”和“定向”[2]?！岸ㄎ弧本褪前严?zāi)じ劫N在玻片的固定位置,一般將蠟?zāi)じ劫N在玻片上除去標(biāo)簽位置后剩余部分的中間位置。對(duì)于方形、長(zhǎng)條形組織和連續(xù)切片的小組織,應(yīng)使方形組織的四邊盡量與玻片四邊平行,長(zhǎng)條形組織、小組織的蠟?zāi)ひ矐?yīng)與玻片兩長(zhǎng)邊平行。這樣做一方面使切片看上去整齊、美觀；另一方面,鏡檢時(shí)減少載物臺(tái)上移動(dòng)器的位移范圍,節(jié)省操作時(shí)間?！岸ㄏ颉本褪墙M織在玻片上的排列要有一定的方向,如皮膚組織切片的表皮層端朝下,管腔類組織切片的黏膜或內(nèi)膜端朝下,實(shí)性組織切片的被膜端朝下,鏡檢時(shí)觀察到的組織圖像就會(huì)倒轉(zhuǎn)過來,變成表皮層端朝上、黏膜端朝上、被膜端朝上,符合一般人的視覺習(xí)慣。另外,撈片時(shí)要注意把握好撈片時(shí)機(jī)和撈片方向,當(dāng)蠟?zāi)ぐ櫿弁耆归_,組織塊沒有明顯擴(kuò)張時(shí),即可撈片；撈片方向是指撈片時(shí)玻片和蠟?zāi)に傻慕嵌?正確的做法是,將玻片沿蠟?zāi)Ｒ欢舜怪辈迦?使蠟?zāi)Ｒ欢伺c玻片接觸后快速而輕盈地提起,輕輕甩去蠟?zāi)Ｅc玻片間的水分,或?qū)⒉ＦQ立放置片刻,待不再有水分流下后即可烤片。

8 染色

染色前切片要進(jìn)行烤片和脫蠟,一般在60～65 ℃溫箱內(nèi)烤片30～60 min,不要將切片水平放在烤片機(jī)上高溫烘烤,這樣會(huì)導(dǎo)致切片內(nèi)的小水滴暴沸將組織撐開。脫蠟時(shí)間寧長(zhǎng)勿短,要根據(jù)脫蠟切片的數(shù)量定期更換脫蠟試劑,一般來說,兩缸各400 ml的二甲苯可以供500張切片脫蠟。加熱和增加振蕩時(shí)間可縮短脫蠟時(shí)間。切片染色前保證脫蠟和水化充分,否則染色后會(huì)出現(xiàn)片狀或點(diǎn)狀灰白色區(qū)域或染色不均區(qū)域。蘇木精和伊紅的染液質(zhì)量對(duì)染色效果影響較大,其中蘇木精和伊紅染液的pH值是影響其染液質(zhì)量最重要的因素之一。保持染液的pH值在2.5左右,對(duì)保障蘇木精和伊紅染液的染色效果至關(guān)重要[3-4]。另外,要把握好蘇木精和伊紅染畢后的分化力度,分化時(shí)間要根據(jù)分化液的質(zhì)量、切片染色情況等靈活掌握。分化時(shí)要充分考慮到核漿對(duì)比和切片的長(zhǎng)期保存。染色完成后,要進(jìn)行充分水洗,以除去組織中殘存的酸或堿,以便切片長(zhǎng)久保存而不褪色。

9 封固

封片要提倡濕封,干封會(huì)引起細(xì)胞收縮、龜裂或切片出現(xiàn)黑色結(jié)晶樣小點(diǎn),影響細(xì)胞折光率改變和觀察效果。封片時(shí)一是要掌握好中性樹膠的濃度和量的多少,濃度太稀膠易溢出玻片,切片保存一段時(shí)間后二甲苯揮發(fā),組織中會(huì)產(chǎn)生空隙,不利切片保存；濃度過高膠過稠散不開,易形成氣泡。膠的濃度為一秒鐘滴下一滴為宜。二是要掌握蓋片時(shí)的速度和角度,取蓋玻片時(shí)要輕拿輕放,以小于30°角度接觸玻片的側(cè)邊,輕輕放下,不要垂直放下,以免產(chǎn)生氣泡。

綜上所述,HE制片過程環(huán)節(jié)較多,每一個(gè)環(huán)節(jié)都有相應(yīng)的質(zhì)控要求和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn),但要做到國(guó)際和國(guó)內(nèi)的統(tǒng)一,還有相當(dāng)長(zhǎng)的路要走。但每一個(gè)制度或標(biāo)準(zhǔn)的建立都要經(jīng)歷從無到有、從少到多、從不完善到逐步完善的過程。在日常的HE制片過程中,技術(shù)人員要不斷探索,勇于創(chuàng)新,認(rèn)真總結(jié)經(jīng)驗(yàn),為HE切片質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化建設(shè)多做貢獻(xiàn)。

[1] 孫琪.病理切片質(zhì)量控制的體會(huì)[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,2(6):444-445.

[2] 凌啟波,梁英杰.HE制片質(zhì)控要求[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2000,16(4):333-334.

[3] 王力,楊舉倫,趙穩(wěn)興,等.Ehrlich 蘇木精染液pH 值變化對(duì)組織染色的影響[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2011,23(3):24-26.

[4] 王力,楊舉倫,趙穩(wěn)興,等.改良Ehrlich 蘇木精染液在HE 染色中的應(yīng)用[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜,2011,27(8):902-903.

650032 昆明,成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院病理科

王 力,E-mail：tlzj.hh@163.com

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1004-0188(2014)09-1035-02

10.3969/j.issn.1004-0188.2014.09.048

2014-07-29)