王文慶，張步增，吳 平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，濟南市，250101

手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服生物負(fù)載水平測定方法介紹

【作 者】王文慶，張步增，吳 平

山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，濟南市，250101

該文首先對手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品生物負(fù)載的定義、生物負(fù)載測定的意義以及指標(biāo)要求進(jìn)行了闡述；隨后，主要針對生物負(fù)載水平的評價方法選擇以及確認(rèn)進(jìn)行具體介紹。

手術(shù)衣；手術(shù)單；潔凈服；生物負(fù)載；潔凈度-微生物；回收率；修正系數(shù)

所謂生物負(fù)載（bio-burden），是指產(chǎn)品上存活微生物的總數(shù)。在YY/T 0506手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服系列標(biāo)準(zhǔn)中，生物負(fù)載又稱為 “潔凈度-微生物”（cleanliness-microbial），它反映的是待滅菌的手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品的微生物污染情況，可為以下方面提供信息：

(1) 手術(shù)衣、手術(shù)單和潔凈服原料生產(chǎn)廠家向其用戶證實原料是在良好的微生物控制環(huán)境下生產(chǎn)的；

(2) 需進(jìn)行輻照滅菌的手術(shù)衣、手術(shù)單和潔凈服產(chǎn)品的滅菌過程確認(rèn)和常規(guī)控制；

(3) 非無菌供應(yīng)手術(shù)衣、手術(shù)單和潔凈服產(chǎn)品生產(chǎn)廠家向其用戶證實的微生物污染控制要求已得到滿足；

(4) 無菌供應(yīng)手術(shù)衣、手術(shù)單和潔凈服產(chǎn)品的滅菌過程控制中，作為對凈化設(shè)施、人流、物流控制系統(tǒng)保持產(chǎn)品潔凈的綜合能力的監(jiān)視手段之一。

YY/T 0506手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服系列標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品的生物負(fù)載水平為lg(CFU/dm2) ≤2。每dm2產(chǎn)品上最多只允許100 CFU的微生物存在。

YY/T 0506手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服系列標(biāo)準(zhǔn)同時規(guī)定[2]，應(yīng)按照ISO 11737-1標(biāo)準(zhǔn)和該標(biāo)準(zhǔn)附錄中的袋蠕動法進(jìn)行微生物試驗以評價產(chǎn)品的潔凈度-微生物。但是ISO 11737-1標(biāo)準(zhǔn)只給出了生物負(fù)載測定方法設(shè)計要求以及對所設(shè)計的方法進(jìn)行確認(rèn)的指南。并沒有針對手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品給出具體的測定方法。

對此，我們根據(jù)ISO 11737-1的要求設(shè)計了一套符合手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品特點的潔凈度-微生物測定方法。該方法的技術(shù)路線是：(1) 設(shè)定適宜的洗脫程序，采用袋蠕動法對試樣上自然污染的微生物進(jìn)行洗脫，對洗脫液進(jìn)行薄膜過濾，并對濾膜進(jìn)行培養(yǎng)計數(shù)，得到試樣上洗脫的微生物總數(shù)；(2) 以產(chǎn)品接種的方式將一定數(shù)量的需氧芽孢接種到滅菌后的相同試樣上，用相同程序進(jìn)行操作，得到洗脫芽孢總數(shù)，用接種芽孢總數(shù)和洗脫芽孢總數(shù)求得修正系數(shù)；(3) 通過修正系數(shù)對試樣上洗脫的微生物總數(shù)進(jìn)行修正，從而確定試樣的生物負(fù)載水平。

1 測定方法

1.1 洗脫菌落數(shù)的測定

試樣洗脫菌落數(shù)測定流程圖見圖1。

圖1 洗脫菌落數(shù)測定流程圖Fig.1 Flow diagram of elution microbial population determination

用1 dm2模板以無菌操作的方式裁取三個試樣，分別記為1號、2號和3號試樣。將三個試樣分別投入3個盛有200 mL無菌氯化鈉注射液的無菌勻漿袋中，將每個勻漿袋分別放入勻漿器中，將洗脫參數(shù)設(shè)定為運行頻率200 r/min，運行時間1 min，啟動勻漿器對試樣分別進(jìn)行洗脫。以無菌操作的方式將濾膜和濾杯裝載于過濾裝置上，將每份體積為200 mL的洗脫液分別經(jīng)兩個濾膜各過濾100 mL，將濾膜菌面朝上分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上。將3個營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板置于35oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，三個玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板置于28oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)[3]。

按式（1）計算每個試樣洗脫的菌落總數(shù)。

式中：

Yi—第i個試樣洗脫的菌落總數(shù)，單位為CFU；

Ai—第i個試樣營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板菌落數(shù)，單位為CFU；

Bi—第i個試樣玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板菌落數(shù)，單位為CFU。

i ＝ 1，2，3；

按式（2）計算三個試樣洗脫的平均菌落數(shù)。

式中：

Y—三個試樣洗脫的平均菌落數(shù)，單位為CFU。

1.2 修正系數(shù)的測定

修正系數(shù)測定流程圖見圖2。

用適宜的方法制備萎縮芽孢桿菌ATCC 9372芽孢懸液保藏備用。臨用前用無菌氯化鈉注射液制備接種懸液，使每0.1 mL接種懸液中含有約100 CFU萎縮芽孢桿菌芽孢。按照“洗脫菌落數(shù)的測定”部分中相同的方法進(jìn)行取樣，分別記為a號、b號和c號試樣，用制造商推薦的滅菌方式對試樣進(jìn)行滅菌，備用。將三個試樣分別置于直徑為150 mm的無菌培養(yǎng)皿中，向每個試樣接種0.1 mL芽孢懸液（約100 CFU），均勻涂布并使其干燥。按照“洗脫菌落數(shù)的測定”部分中相同的洗脫方法對接種試樣進(jìn)行洗脫。以無菌操作的方式將濾膜和濾杯裝載于過濾裝置上，將三份體積為200 mL的洗脫液分別進(jìn)行薄膜過濾，將濾膜菌面朝上分別貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上。將三個貼有濾膜的平板置于35oC恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)。

圖2 修正系數(shù)測定流程圖Fig.2 Flow diagram of correction factor determination

按式（3）計算三個試樣洗脫的平均菌落數(shù)。

式中：

X— 三個試樣洗脫平均菌落數(shù)，單位為CFU；Xa— 試樣a洗脫菌落數(shù)，單位為CFU；

Xb— 試樣b洗脫菌落數(shù)，單位為CFU；

Xc—試樣c洗脫菌落數(shù)，單位為CFU。

按式（4）計算回收率。

式中：

R— 回收率；

X— 三個試樣洗脫平均菌落數(shù)，單位為CFU；

Z — 接種芽孢數(shù)，單位為CFU。

按式（5）計算修正系數(shù)。

f — 修正系數(shù)；R — 回收率。

1.3 生物負(fù)載水平（潔凈度—微生物）的計算

按式(6)進(jìn)行潔凈度-微生物的計算。

式中：

M — 潔凈度-微生物；

f — 修正系數(shù)；

Y— 三個試樣洗脫平均菌落數(shù)，單位為CFU。

2 方法解釋和說明

ISO 11737-1中提到，“對特定技術(shù)而言，提高回收率能增加生物負(fù)載測定的準(zhǔn)確度。若發(fā)現(xiàn)回收率低于50%，應(yīng)考慮技術(shù)改進(jìn)或使用替代技術(shù)。應(yīng)注意存在回收率不高于50%的某些情況”[4]。通過試驗驗證我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將勻漿器的運行頻率設(shè)定為200 r/min，運行時間設(shè)定為1 min時，大部分產(chǎn)品能有較高的回收率。進(jìn)行生物負(fù)載測定時，我們推薦優(yōu)先考慮此洗脫參數(shù)。但是我們同時也發(fā)現(xiàn)，并不是所有的產(chǎn)品在此洗脫參數(shù)下都有較高的回收率，比如某些水刺無紡布產(chǎn)品，在此洗脫參數(shù)下就沒有獲得較高的回收率。所以，當(dāng)有回收率低于50%的情況出現(xiàn)時，可考慮對洗脫參數(shù)進(jìn)行調(diào)整和/或加入表面活性劑等。對個別產(chǎn)品，如果有足夠的證據(jù)表明洗脫回收率不可能高于50%，這時應(yīng)按能獲得最高回收率的試驗方法進(jìn)行測定。

我們采用的修正系數(shù)的測定方法為ISO 11737-1中給出的產(chǎn)品接種法，即通過向產(chǎn)品接種一定數(shù)量的選定的微生物，形成人工負(fù)載，用來確立回收率。該方法建立了一個模型系統(tǒng)，比較適用于生物負(fù)載比較低的產(chǎn)品的測定。在ISO 11737-1中，除了產(chǎn)品接種法外還有另外一種方法——重復(fù)處理法，該方法的原理是對產(chǎn)品上自然存在的微生物進(jìn)行重復(fù)洗脫處理，直到回收的微生物累計數(shù)量沒有明顯增加。每重復(fù)一次都將洗脫液從產(chǎn)品或產(chǎn)品部分上完全回收并計數(shù)，比較連續(xù)回收得到的累計結(jié)果。我們沒有選擇重復(fù)處理法的原因，主要是因為手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品本身是在凈化條件下生產(chǎn)，一般情況下其自然污染率都比較低，采用重復(fù)處理法很難得到具有統(tǒng)計意義的試驗結(jié)果，我們的驗證試驗也證實了這一點。

在特定產(chǎn)品的常規(guī)檢驗中，尤其是對于具有較高洗脫回收率的產(chǎn)品，不必每次檢驗都測定修正系數(shù)。在方法沒有改變的前提下，可以利用已得到的修正系數(shù)進(jìn)行結(jié)果計算，使檢驗方法得到簡化。不過，建議能周期性地對回收率/修正系數(shù)進(jìn)行確認(rèn)。

3 總結(jié)

傳統(tǒng)的微生物檢驗方法，比如藥品等的微生物總數(shù)測定，其樣品本身一般都可以以特定的方法溶解，得到的供試液中的微生物即可代表樣品本身的微生物，一般不涉及洗脫的問題。而大部分醫(yī)療器械產(chǎn)品，比如本文所述的手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品，其性狀決定了必須對其進(jìn)行洗脫，然后才能對洗脫液進(jìn)行生物負(fù)載的測定。在這種情況下，如果不對方法的洗脫率進(jìn)行研究，而只是單純地采用傳統(tǒng)的微生物檢驗方法進(jìn)行生物負(fù)載測定，勢必導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。本文介紹的方法與傳統(tǒng)的微生物檢驗方法的最大不同之處就是，在傳統(tǒng)微生物檢驗方法的基礎(chǔ)上引進(jìn)了修正系數(shù)的概念，對傳統(tǒng)微生物檢驗方法的檢驗結(jié)果進(jìn)行修正，以得到準(zhǔn)確的試驗結(jié)果。我們希望通過本文的撰寫能夠幫助相關(guān)人員理解YY/T0 506中潔凈度-微生物的概念，掌握手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服產(chǎn)品生物負(fù)載的測定方法，加深對ISO 11737-1標(biāo)準(zhǔn)中醫(yī)療器械生物負(fù)載測定理念和方法的理解。

[1] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. YY/T 0506.2-2009 病人, 醫(yī)護(hù)人員和器械用手術(shù)單、手術(shù)衣和潔凈服 第2部分: 性能要求和性能水平[S].

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. YY/T 0506.3-2005 病人, 醫(yī)護(hù)人員和器械用手術(shù)單, 手術(shù)衣和潔凈服 第3部分: 試驗方法[S].

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部. 中華人民共和國藥典[S]. 2010.

[4] International Organization for Standardization. ISO 11737-1: 2006 Sterilization of medical devices - Microbiological methods - Part 1: Determination of a population of microorganisms on products[S].

Introduction to Method for Determination of Bio-burden on Surgical Drapes, Gowns and Clean Air Suits

【 Writers 】Wang Wenqing, Zhang Buzeng, Wu Ping
Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices, Jinan, 250101

surgical drapes, surgical gowns, clean air suits, bio-burden，cleanliness-microbial, recovery ef fi ciency, correction factor

R187

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.02.017

1671-7104(2014)02-0138-03

2013-08-36

王文慶， E-mail: wangwenqing80@hotmail.com

【 Abstract 】Firstly, the essay introduces the definition of bio-burden, the significance of determination of bio-burden and the speci fi c performance requirements. Then, the essay introduces the method selection and validation on the bio-burden determination of surgical drapes, gowns and clean air suits.