陳倫佳，王婧，韓舜愈，宋蕤，陳凱

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

不同條件對炭黑曲霉產(chǎn)赭曲霉毒素A能力的影響

陳倫佳，王婧，韓舜愈*，宋蕤，陳凱

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070）

為了解一株分離自新疆葡萄園的炭黑曲霉菌株在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生赭曲霉毒素A（OTA）的能力，試驗采用孟加拉紅培養(yǎng)基，利用高效液相-熒光法對OTA進(jìn)行定量檢測，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)毒條件。結(jié)果表明，對該菌株產(chǎn)生OTA的條件影響從大到小依次為葡萄糖質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2質(zhì)量濃度。最優(yōu)產(chǎn)毒條件：在溫度28℃條件下，葡萄糖質(zhì)量濃度92.26g/L、SO2質(zhì)量濃度8.26mg/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)0.05%。在此條件下，OTA產(chǎn)量為7.427ng/mL。

赭曲霉毒素A；炭黑曲霉CXT11；產(chǎn)毒條件；響應(yīng)面

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是曲霉菌屬（Aspergillus）和青霉菌屬（Penicillium）的某些種產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其代表菌為炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）以及疣孢青霉（Penicillium verrusosum）[1]。OTA是一種無色結(jié)晶化合物，具有耐熱性，易溶于稀的碳酸氫鈉溶液和極性有機(jī)溶劑，微溶于水，在紫外光的照射下呈綠色熒光，是由L-β-苯丙氨酸與7-羥基-5-氯-3，4-二氫-8-羥基-3R-甲基異香豆素通過肽鍵連接而成[2]，分子式為C20H18ClNO6[3]，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。OTA具有耐熱性，焙烤只能使其毒性減少20%，蒸煮對其毒性不具有破壞作用[4-5]。

圖1 OTA化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of OTA

OTA廣泛存在于各種食物中，對人類的危害僅次于黃曲霉毒素，主要危及人和動物腎臟[6]，同時對免疫系統(tǒng)也有毒性，還具有致畸、致癌、致突變作用[7]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其定義為2B類致癌物[8-9]。OTA在葡萄中的危害僅次于谷物[10]。釀酒葡萄成為葡萄酒中OTA的主要來源。葡萄酒中的OTA由ZIMMERLI B等[11]首次檢測出。隨后，澳大利亞、法國、西班牙等許多國家都報道了葡萄酒中OTA的存在[12]。因此，各國對葡萄酒中OTA的含量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定。歐盟（european union，EU）委員會在2005年制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，葡萄酒以及用于飲料制作的葡萄汁中OTA限量為2.0μg/L[13]，而國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)暫時未確定。

目前已有關(guān)于培養(yǎng)溫度[14]、時間[15]、水分活度[16-17]、酵母浸膏[18]以及Zn2+、Mg2+[19]等條件對不同產(chǎn)毒菌株產(chǎn)OTA影響的研究，然而，關(guān)于總糖、SO2、乙醇等對產(chǎn)毒菌株產(chǎn)OTA影響的研究報道較少。研究以分離自新疆吐魯番葡萄園的1株炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）為研究對象，通過單因素試驗和響應(yīng)面分析（response surface methodol-ogy，RSM）的方法，研究炭黑曲霉在不同葡萄糖、SO2和乙醇含量等條件下的產(chǎn)毒能力，以期為如何減少葡萄酒中OTA含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)OTA炭黑曲霉菌株CXT11分離自新疆吐魯番葡萄園葡萄漿果，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院葡萄酒重點實驗室提供；

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5g，瓊脂20g，1/3 000孟加拉紅溶液100mL，氯霉素0.1g，蒸餾水1 000mL。121℃高溫滅菌20min；

赭曲霉毒素A標(biāo)品（純度98%）：青島日水生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC2695高效液相色譜儀（裝有熒光檢測器）：美國Waters公司；Cence H2050R高速冷凍離心機(jī)：湖南湘潭湘儀儀器有限公司；SPX-GB光照培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將供試菌株接種于孟加拉紅培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7d，用無菌水沖洗平板表面收集孢子后，用滅菌的紗布過濾，取0.1mL滴于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下觀察菌懸液的濃度，調(diào)整菌懸液孢子的濃度至3.0×108CFU/mL。

1.3.2 OTA的提取

在無菌條件下，將上述培養(yǎng)的菌液每個樣品吸取2mL，加入2mL OTA提取液（甲醇∶水=8∶2，v/v），充分混合，10 000r/min離心10min。取上清液用d=0.22μm的濾膜過濾，用高效液相色譜儀檢測。

1.3.3 高效液相色譜法對OTA的定量檢測

參考SN/T1940—2007《進(jìn)出口食品中赭曲霉毒素A的測定方法》[20]并改進(jìn)。將1mg OTA標(biāo)品溶于1mL的甲醇水溶液（1∶1，v/v）配制成1mg/mL的OTA原液。吸取10μL該原液稀釋于10mL的甲醇水溶液（1∶1，v/v）中，制成1μg/mL的OTA儲備液，-20℃保藏備用。

從OTA儲備液中分別移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1 000μL稀釋至10mL，依次得到質(zhì)量濃度為2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的OTA標(biāo)品溶液，經(jīng)高效液相色譜儀檢測后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

高效液相色譜條件。色譜柱：ACQUITYBEH C18不銹鋼柱（1.0mm×50mm×1.7μm）；流動相：甲醇/乙酸銨（80mmol/L）=45∶55，梯度洗脫；流速：1mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10μL；熒光檢測器：激發(fā)波長360nm，發(fā)射波長440nm。

1.3.4 單因素試驗

選擇SO2、乙醇及葡萄糖含量作為影響產(chǎn)毒的主要因素，通過單因素試驗選取響應(yīng)面試驗的因素和水平。

（1）培養(yǎng)液SO2質(zhì)量濃度對產(chǎn)生OTA的影響

吸取1mL 3.0×108CFU/mL菌懸液接種至20mL孟加拉紅液體培養(yǎng)基中，分別加入一定量的偏重亞硫酸鈉溶液使其質(zhì)量濃度為0、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，28℃搖床培養(yǎng)9d。用高效液相色譜儀測定各樣品OTA含量。

（2）培養(yǎng)液乙醇體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)生OTA的影響

吸取3.0×108CFU/mL菌懸液1mL接種至20mL孟加拉紅液體培養(yǎng)基中，分別加入一定量乙醇溶液使其體積分?jǐn)?shù)為0%，3%、6%、9%、12%，28℃搖床培養(yǎng)9d。用高效液相色譜儀測定各樣品OTA含量。

（3）培養(yǎng)液葡萄糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)生OTA的影響

吸取1mL 3.0×108CFU/mL菌懸液接種至20mL孟加拉紅液體培養(yǎng)基中，分別加入一定量葡萄糖使其質(zhì)量濃度相應(yīng)為50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L，28℃搖床培養(yǎng)9d。用高效液相色譜儀測定各樣品OTA含量。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化炭黑曲霉CXT11產(chǎn)毒條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取葡萄糖質(zhì)量濃度（X1）、SO2質(zhì)量濃度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）3個因素作為自變量，以O(shè)TA含量為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行中心組合試驗設(shè)計。每個試驗重復(fù)3次，取其平均值，試驗因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 模型的驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化炭黑曲霉的產(chǎn)毒條件，并以優(yōu)化后的條件參數(shù)進(jìn)行培養(yǎng)試驗，比較模型預(yù)測值和試驗值，驗證模型的有效性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗重復(fù)3次，取其平均值。采用SAS 8.1及Microsoft Excel 2003統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 8.05b軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

用高效液相色譜法檢測OTA含量，OTA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖見圖2。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，OTA質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

由圖2可知，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程式為Y=607.7X+890.49，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 8，表明二者線性關(guān)系良好。

圖2 OTA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC figure of standard ochratoxin A solution

圖3 OTA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of ochratoxin A

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)液中SO2質(zhì)量濃度對產(chǎn)生OTA的影響

圖4 SO2含量對菌株CXT11產(chǎn)毒的影響Fig.4 Effect of SO2content on OTA production by strain CXT11

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)液中SO2質(zhì)量濃度在0～25mg/L時菌株CXT11產(chǎn)生OTA的能力反而有一定程度的增加，當(dāng)SO2質(zhì)量濃度超過25mg/L時，隨著SO2含量的增加，菌株CXT11產(chǎn)毒量呈明顯的下降趨勢。對于SO2質(zhì)量濃度在0～25mg/L時OTA少量增加的原因分析，可能是因為SO2的加入降低了溶液的pH，低pH值促進(jìn)了菌株CXT11產(chǎn)生OTA毒素，說明外源pH環(huán)境對OTA的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對產(chǎn)生OTA的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對菌株CXT11產(chǎn)毒的影響Fig.5 Effect of ethanol content on OTA production by strain CXT11

由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，菌株CXT11產(chǎn)生OTA的能力呈明顯的下降趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>10%時，OTA幾乎檢測不到，說明較高的乙醇體積分?jǐn)?shù)能夠抑制菌株產(chǎn)毒。

2.2.3 葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株CXT11產(chǎn)生OTA的影響

圖6 葡萄糖含量對菌株CXT11產(chǎn)毒的影響Fig.6 Effect of glucose content on OTA production by strain CXT11

由圖6可知，菌株CXT11產(chǎn)OTA量在0～100g/L葡萄糖質(zhì)量濃度內(nèi)呈較緩慢的上升趨勢，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度超過100g/L時下降較為明顯。這是否因為細(xì)胞滲透壓的改變而影響了產(chǎn)毒，其原因還有待進(jìn)一步研究。

2.3 響應(yīng)面分析法對菌株CXT11產(chǎn)毒條件優(yōu)化

對葡萄糖質(zhì)量濃度（X1）、SO2質(zhì)量濃度（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）進(jìn)行了3因素3水平響應(yīng)面分析，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方案結(jié)果見表2和表3。

利用Design-Expert8.05對表2的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、參數(shù)估計及顯著性檢驗，具體結(jié)果分析見表3，得到OTA產(chǎn)量與葡萄糖質(zhì)量濃度、SO2質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)三元二次回歸方程為：

從表3可知，響應(yīng)面回歸模型達(dá)到極顯著（P＜0.01）；失擬檢驗不顯著（P＞0.05），說明模型所擬合的二次回歸方程與實際相符合，能正確反映OTA產(chǎn)量與X1、X2和X3之間的關(guān)系，回歸模型可以較好地對優(yōu)化試驗中的各種試驗結(jié)果進(jìn)行預(yù)測。顯著性檢驗結(jié)果表明，二次項中葡萄糖質(zhì)量濃度、SO2質(zhì)量濃度與乙醇體積分?jǐn)?shù)均對OTA產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05）。一次項中葡萄糖質(zhì)量濃度與乙醇體積分?jǐn)?shù)對OTA產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05）。決定系數(shù)R2為0.927 3，說明模型的擬合度好，OTA的實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合相關(guān)性。方差分析結(jié)果表明，各因素對真菌產(chǎn)OTA毒素影響由大到小順序依次為葡萄糖質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2質(zhì)量濃度。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design and result of response surface analysis experiment

表3 回歸模型方差分析及其系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Variance analysis of regression model and coefficient of significance test

對葡萄糖質(zhì)量濃度、SO2質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)3個因素，兩兩交互作用分析，得到交互因子的響應(yīng)曲面圖及等高線見圖7。等高線圖表示在同一橢圓型的區(qū)域內(nèi)，OTA產(chǎn)量是相同的。在橢圓形區(qū)域中心，OTA產(chǎn)量最低，由中心向邊緣逐漸增大。橢圓排列越密集，說明因素變化對OTA產(chǎn)量影響越大。同時等高線的形狀可以反映出交互作用的大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著；而圓形則與之相反，此時兩因素交互作用不顯著。由圖6可知，兩兩交互作用分析，兩者之間的交互作用皆不顯著。

圖7 各因素對OTA產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.7 Response surface plot and contour line of interaction factors on ochratoxin A production

通過回歸方程對各因素求最大值，得出菌株CXT11產(chǎn)OTA的最佳參數(shù)為葡萄糖質(zhì)量濃度92.26g/L、SO2質(zhì)量濃度8.26mg/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)0.05%。在此最優(yōu)條件下，得OTA產(chǎn)量為7.596ng/mL。

2.4 驗證試驗

為了進(jìn)一步驗證響應(yīng)面分析法的可靠性，采用上述最優(yōu)條件培養(yǎng)菌株CXT11，實際測得OTA產(chǎn)量為7.427ng/mL，誤差為2.22%，與未處理的菌株產(chǎn)OTA 6.087ng/mL相比升高了1.34ng/mL。因此，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的菌株CXT11產(chǎn)OTA的參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

建立了以菌株CXT11的OTA產(chǎn)量為響應(yīng)值，以葡萄糖質(zhì)量濃度、SO2質(zhì)量濃度和乙醇體積分?jǐn)?shù)為因影響子的數(shù)學(xué)模型，由該模型得到各因素對真菌產(chǎn)OTA毒素影響大小順序依次為葡萄糖質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2質(zhì)量濃度。產(chǎn)毒的最佳參數(shù)為葡萄糖質(zhì)量濃度92.26g/L、SO2質(zhì)量濃度8.26mg/L、乙醇體積分?jǐn)?shù)0.05%。驗證試驗結(jié)果表明，OTA實際產(chǎn)量為7.427ng/mL，與未處理的菌株OTA產(chǎn)量6.087ng/mL相比升高了1.34ng/mL。

因此，在葡萄破碎后，即葡萄糖質(zhì)量濃度較高、乙醇含量較低時，最有利于潛在產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生OTA。添加一定量SO2能有效抑制其產(chǎn)毒，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乙醇含量的增加同樣會抑制其產(chǎn)毒，為控制葡萄酒中OTA含量提供可行性方法。

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Effect of different conditions on ochratoxin A production byAspergillus carbonarius

CHEN Lunjia,WANG Jing,HAN Shunyu*,SONG Rui,CHEN Kai
(College of Food Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To understand the ochratoxin A(OTA)production byAspergillus carbonariusCXT11 isolated from the grape of Xinjiang province,the OTA content was determined by HPLC-fluorescence after cultured by rose bengal medium.On the basis of single factor experiment,response surface methodology was adopted to optimize the OTA production condition.The effect of different factors on OTA production in order was glucose concentration,ethanol content,SO2concentration.The optimum OTA production condition was obtained as follows:temperature 28℃,glucose concentration 92.26 g/L,SO2concentration 8.26 mg/L,ethanol 0.05%.Under this condition,the OTA production was 7.427 ng/ml.

ochratoxin A;Aspergillus carbonariusCXT11;toxin-producing conditions;response surface methodology

Q949.327.1

A

0254-5071（2014）04-0039-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.010

2014-02-18

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)專項（GNSW-2013-16）

陳倫佳（1988-），男，碩士研究生，研究方向為葡萄酒中存在的真菌毒素。

*通訊作者：韓舜愈（1963-），男，教授，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析。