王 洋， 武利慶， 楊 屹

（1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

UPLC-Q-TOF快速測(cè)定常見(jiàn)氨基酸含量

王 洋1， 武利慶2， 楊 屹1

（1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

結(jié)合外標(biāo)法或同位素稀釋質(zhì)譜法，建立UPLC-Q-TOF快速定量氨基酸分析方法。在無(wú)離子對(duì)試劑及衍生化情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中氨基酸的快速測(cè)定。采用外標(biāo)法測(cè)定時(shí)，14種常見(jiàn)氨基酸在其相應(yīng)線性范圍內(nèi)，r2為0.953～0.999，LOD為0.001～0.080mg/g，CV為1.4%～9.8%；采用Q-TOF外標(biāo)法定量時(shí)，CV為1.5%～8.0%，誤差為-9.1%～40%；采用同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定各氨基酸濃度時(shí)，CV為1.4%～3.8%，誤差為-3.4%～3.7%。本方法可在2min之內(nèi)完成14種氨基酸的分離和定量，大大縮短分析時(shí)間。同時(shí)由于采用高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜，避免檢測(cè)時(shí)離子間的相互干擾，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，可用于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及定量。

氨基酸；UPLC-Q-TOF；定量；外標(biāo)法；同位素稀釋；質(zhì)譜

0 引 言

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單元，氨基酸分析是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法，準(zhǔn)確測(cè)定樣品中氨基酸含量是蛋白質(zhì)準(zhǔn)確定量的前提。

目前，氨基酸的分析檢測(cè)方法主要有反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[1]、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜法（CE-MS）[2]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[3]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）[4]。在采用RP-HPLC和CE作為分離手段時(shí)，往往需要將待測(cè)樣品衍生、轉(zhuǎn)化為具有紫外可見(jiàn)吸收或能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，以便于檢測(cè)。在采用GC時(shí)，也要在柱前將待測(cè)樣品衍生為易揮發(fā)性物質(zhì)才可以[5]。而衍生試劑不穩(wěn)定、衍生化操作繁瑣，衍生出的副產(chǎn)物會(huì)干擾分析，具有重現(xiàn)性差、準(zhǔn)確度低等缺陷[6]。LC-MS分析時(shí)，在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑可以提高氨基酸在反相色譜柱中的保留，省去衍生化的繁瑣過(guò)程；但是，離子對(duì)試劑會(huì)抑制信號(hào)強(qiáng)度，通常LC-MS分析時(shí)間為十幾到幾十分鐘[7-10]。

為了克服上述方法的缺點(diǎn)，Qu等[11]首先嘗試在不使用離子對(duì)試劑的情況下采用三重四級(jí)桿（QQQ）質(zhì)譜進(jìn)行氨基酸定量，此時(shí)各種氨基酸得不到充分的分離，譜峰重疊嚴(yán)重，由于質(zhì)譜分辨率較低，對(duì)定性和定量分析造成了干擾。本文借助飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flight，TOF）的高分辨能力，在不使用離子對(duì)試劑的情況下對(duì)14種常見(jiàn)氨基酸進(jìn)行分離，克服了譜峰重疊干擾和離子歧視效應(yīng)，取得了較為滿意的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

nanoUPLC-Synapt G2（Waters公司）；TSQ Vantage（Thermo Fisher公司）。超純水（取自Milli-Q，MILLIPORE），乙腈（色譜純），甲酸（分析純），全氟庚酸（純度98%），三氟乙酸（色譜純），非標(biāo)記氨基酸（美國(guó)Sigma Aldrich公司），標(biāo)記氨基酸（美國(guó)劍橋同位素公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

外標(biāo)法：準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為10mg/g的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋至從0.01，0.1，1，3，5mg/g小到大。另配氨基酸質(zhì)量濃度約為0.1mg/g的溶液作為待測(cè)樣品。

同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-MS）：分別取1 mg/g脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸配制成非標(biāo)記混標(biāo)及與其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記氨基酸混標(biāo)。配制成高標(biāo)、低標(biāo)和待定值樣品。

1.3 四級(jí)桿-飛行時(shí)間（Q-TOF）質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)參數(shù)

1.4 三重四級(jí)桿（QQQ）質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)參數(shù)

色譜條件：色譜柱為Agilent SB-Aq，2.1 mm×100mm；流速0.2mL/min，梯度條件見(jiàn)表1，A相是含0.8mmol PFHA和0.05%TFA的水溶液，B相是乙腈（表1）。采用Thermo Fisher公司的TSQ Vantage質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式捕獲：苯丙氨酸（166→120），苯丙氨酸-13C9（175→128），脯氨酸（116→70），脯氨酸-13C5（121→74），纈氨酸（118→72），纈氨酸-13C5（123→76），亮氨酸（132→86），亮氨酸-D10（142→96）。

1.5 溶菌酶水解

1）準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為1mg/mL蛋白溶液。

2）根據(jù)蛋白的氨基酸中纈氨酸含量，配制非標(biāo)記混標(biāo)、標(biāo)記混標(biāo)溶液。

3）取等量蛋白溶液和標(biāo)記混標(biāo)溶液，置于2 mL安瓿瓶中，40℃離心干燥。

4）加500 μL 6 mol/L鹽酸，氮吹2 min，封口。110℃，烘24h。

5）取出后，氮?dú)獯蹈?，?00μL 0.1 mol/L鹽酸，過(guò)濾，同時(shí)配制相應(yīng)的低標(biāo)和高標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

變異系數(shù)：

式中：xi——測(cè)定結(jié)果；

n——總共實(shí)驗(yàn)次數(shù)；

i——實(shí)驗(yàn)編號(hào)。

誤差：

式中：c測(cè)——測(cè)出的氨基酸質(zhì)量濃度；

c標(biāo)準(zhǔn)值——用氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的氨基酸

質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 nano-UPLC-Q-TOF質(zhì)譜法評(píng)價(jià)

當(dāng)采用外標(biāo)法進(jìn)行定量時(shí)（見(jiàn)表2），14種氨基酸在0.01～10mg/g范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，r2的范圍為 0.953～0.999，LOD 0.001～0.080 mg/g，CV 1.4%～9.8%。Q-TOF外標(biāo)法定量的結(jié)果與傳統(tǒng)的QQQ外標(biāo)法定量結(jié)果相比（見(jiàn)表3），Q-TOF外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值之間的的誤差范圍為-9.1%～40%，CV為1.5%～8.0%；傳統(tǒng)的QQQ分析方法對(duì)同種樣品分析結(jié)果的的誤差為-9.1%～20%，CV為0.13%～7.8%?？梢?jiàn)，由于Q-TOF質(zhì)譜檢測(cè)原理的限制，基于Q-TOF的氨基酸定量結(jié)果的準(zhǔn)確度及重復(fù)性不如傳統(tǒng)的三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜；但是，其準(zhǔn)確度和重復(fù)性也能滿足一般的應(yīng)用需求，尤其是基于Q-TOF的氨基酸定量可以在不使用離子對(duì)的情況下將14種氨基酸在2 min內(nèi)出峰完畢進(jìn)行定量，與文獻(xiàn)[7-10]相比，大大地縮短了分析時(shí)間。采用Q-TOF質(zhì)譜，與文獻(xiàn)[11]中不添加離子對(duì)試劑的QQQ質(zhì)譜法相比，Q-TOF高分辨、無(wú)離子歧視效應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，使得氨基酸檢測(cè)與定量更加準(zhǔn)確。

表1 QQQ-ID-MS定量氨基酸的液相梯度條件

表2 外標(biāo)法測(cè)定氨基酸得到的方法學(xué)參數(shù)

表3 兩種不同分析方法的外標(biāo)法定值結(jié)果比較（n=5）

同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-MS）是一種高準(zhǔn)確度的蛋白絕對(duì)定量方法，所以本文還對(duì)基于Q-TOF的ID-MS方法進(jìn)行了研究。將蛋白質(zhì)定量中常用的4種穩(wěn)定氨基酸（脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸）配制成混標(biāo)溶液，采用括弧法對(duì)樣品溶液中目標(biāo)氨基酸的濃度進(jìn)行ID-MS分析?；赒-TOF的氨基酸IDMS定量結(jié)果與傳統(tǒng)的QQQ質(zhì)譜定量結(jié)果相比（見(jiàn)表4），前者與標(biāo)準(zhǔn)值之間的的誤差范圍為-3.4%～3.7%，CV為1.4%～3.8%；而后者對(duì)同種樣品IDMS定量結(jié)果的誤差為-1.4%～1.2%，CV為0.7%～2.5%。可見(jiàn)，當(dāng)使用同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo)時(shí)，顯著提升了Q-TOF在定量方面的方法學(xué)性能，同時(shí)具備不使用離子對(duì)試劑、分析速度快的優(yōu)點(diǎn)，可用于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及定值中。

表4 兩種不同分析方法的ID-MS定值結(jié)果比較（n=6）

2.2 nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法的應(yīng)用

為了檢驗(yàn)nano-UPLC-Q-TOF IDMS方法在蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的應(yīng)用，將其應(yīng)用于溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)中。隨機(jī)選取7瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，水解后通過(guò)測(cè)定水解液中纈氨酸的含量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的瓶間均勻性，同時(shí)與QQQ質(zhì)譜的的評(píng)價(jià)結(jié)果相比較，見(jiàn)表5和表6。兩種方法得到的溶菌酶質(zhì)量濃度分別為0.891g/g和0.887g/g，經(jīng)t檢驗(yàn)，p=0.73457，可見(jiàn)兩種方法的測(cè)定結(jié)果差異不顯著；采用兩種方法均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量F值均小于查表值，說(shuō)明溶菌酶樣品是均勻的，兩種方法得到的結(jié)論一致。由于QTOF質(zhì)譜法的分析時(shí)間遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的QQQ質(zhì)譜方法，因此，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)等需要大量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用Q-TOF質(zhì)譜法可以顯著縮短分析時(shí)間。

表5 Q-TOF質(zhì)譜應(yīng)用于ID-MS測(cè)定溶菌酶均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

表6 QQQ質(zhì)譜應(yīng)用于ID-MS測(cè)定溶菌酶均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)束語(yǔ)

本文建立了nano-UPLC-Q-TOF質(zhì)譜法快速檢測(cè)、定量樣品中氨基酸含量的方法，不需添加離子對(duì)試劑和氨基酸衍生化，操作更簡(jiǎn)便。采用外標(biāo)法測(cè)定時(shí)，14種常見(jiàn)氨基酸在0.01～10 mg/g范圍內(nèi)r2為0.953～0.999，LOD為0.001～0.080 mg/g，CV為1.4%～9.8%。采用Q-TOF外標(biāo)法定量氨基酸濃度時(shí)，CV為1.5%～8.0%，與標(biāo)準(zhǔn)值相比誤差為-9.1%～40%；采用ID-MS測(cè)定各氨基酸濃度時(shí)，CV為1.4%～3.8%，與標(biāo)準(zhǔn)值相比的誤差為-3.4%～3.7%。本方法可在2min之內(nèi)完成14種氨基酸的分離和定量，大大縮短了分析時(shí)間。同時(shí)由于采用了高分辨的飛行時(shí)間質(zhì)譜，避免了檢測(cè)時(shí)離子間的相互干擾，提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本方法與傳統(tǒng)QQQ質(zhì)譜分析方法相比，在外標(biāo)法測(cè)定氨基酸含量時(shí)雖然不如QQQ方法的準(zhǔn)確度與重復(fù)性好，但是也能滿足一般要求；在IDMS測(cè)定氨基酸含量時(shí)，由于采用同位素內(nèi)標(biāo)消除了樣品前處理、離子化效率、分離過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，顯著提升了基于Q-TOF定量的準(zhǔn)確度，準(zhǔn)確度與重復(fù)性都能控制在4%以內(nèi)；在提升準(zhǔn)確度和重復(fù)性的同時(shí)，能夠簡(jiǎn)化流動(dòng)相配制、縮短分析時(shí)間，可用于需要大量重復(fù)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的場(chǎng)合，在基本不損失準(zhǔn)確度的情況下顯著節(jié)約分析時(shí)間和分析成本，可用于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及定值實(shí)驗(yàn)等。

[1]Zhang X，Zhao T，Cheng T，et al.Rapid resolution liquid chromatography（RRLC）analysis of amino acids using pre-column derivatization[J].J Chromatogr B，2012（906）：91-95.

[2]Ueno Y，Ajito K，Kukutsu N，et al.Quantitative analysis of amino acids in dietary supplements using terahertz time-domain spectroscopy[J].Anal Sci，2011（27）：351-356.

[3]Peris-V J，Adelantado J V，Carb’o M T D，et al. Characterization of proteinaceous glues in old paintings by separation of the o-phtalaldehyde derivatives of their amino acids by liquid chromatography with fluorescence detection[J].Talanta，2006（68）：1648-1654.

[4]Shen F，Niu X，Yang D，et al.Determination of amino acids in chinese rice wine by fourier transform near-infrared spectroscopy[J].J Agric food Chem，2010（58）：9809-9816.

[5]Tripp J A，McCullagh J S O，Hedges R E M.Preparative separation of underivatized amino acids for compound-specific stable isotope analysis and radiocarbon dating of hydrolyzed bone collagen[J].J Sep Sci，2006（29）：41-48.

[6]Guo S，Duan J，Qian D，et al.Rapid determination of amino acids in fruits of ziziphus jujuba by hydrophilic interaction ultra-high-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupole mass spectrometry[J].J Agric food Chem，2013（61）：2709-2719.

[7]Arienzo M，Martino A D，Capasso R，et al.Analysis of carbohydrates and amino acids in vegetable waste waters by ion chromatography phytochem[J].Anal，2003（14）：74-82.

[8]Nimbalkar M S，Pai S R，Pawar N V，et al.Free amino acid profiling in grain amaranth using LC-MS/MS[J]. Food Chem，2012（134）：2565-2569.

[9]Samy S，Robinson J，Hays M D.An advanced LC-MS（Q-TOF）technique for the detection of amino acids in atmospheric aerosols[J].Anal Bioanal Chem，2011（401）：3103-3113.

[10]Zoppa M，Gallo L，Zacchello F，et al.Method for the quantification of underivatized amino acids on dry blood spots from newborn screening by HPLC-ESI-MS/MS[J]. J Chromatogr B，2006（831）：267-273.

[11]Qu J，Chen W，Luo G，et al.Rapid determination of underivatized pyroglutamic acid，glutamic acid，glutamine and other relevant amino acids in fermentation media by LC-MS-MS[J].Analyst，2002（127）：66-69.

Rapid method of quantitative detection of common amino acids with UPLC-Q-TOF

WANG Yang1，WU Li-qing2，YANG Yi1
（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

In this work，a new method of UPLC-Q-TOF had been proposed for the rapid and accurate detection of common amino acids.Without derivatization and using ion-pair regent，amino acids were analyzed fast and accurately.This study could be applied with both external standard method and ID-MS.For external standard method，ther2of each amino acid was from 0.953 to 0.999，the LOD was from 0.001 mg/g to 0.080 mg/g and the CV was from 1.4%to 9.8%.For the quantitation of 14 amino acids with the external standard method，the CV was from 1.5%to 8.0% and the bias was from-9.1%to 40%compared with standard values.For ID-MS，the CV was from 1.4%to 3.8%and the bias was from-3.4%to 3.7%compared with standard values.14 common amino acids could be analyzed in 2 minutes，which reduced the analysis time greatly.With highresolution TOF mass spectrometry，this method avoids the interference of ion overlapping，which can improve the accuracy of measurement results，and will be well applied in homogeneity and stability testing of protein certified reference materials.

amino acids；UPLC-Q-TOF；quantitation；external standard；isotope dilution；mass spectrometry

O517；O629.73；O657.63；TM930.114

：A

：1674-5124（2014）05-0070-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.018

2013-12-25；

：2014-02-02

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAK26B04）國(guó)家質(zhì)檢總局科技項(xiàng)目（2013QK048，201310008）

王 洋（1988-），女，天津市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。