韓瓊，李燕燕，杜菲，馮津萍

脂多糖誘導高脂家兔動脈血管重塑的研究

韓瓊，李燕燕，杜菲，馮津萍

目的：探討高血脂和慢性炎癥導致高脂血兔血管重塑的病生理機制。

方法：建立高血脂和慢性炎癥動物模型，隨機分4組：對照組（n=5）、高脂組（n=10）、脂多糖組（n=10）和高脂+脂多糖組（n=10）。Masson染色，觀察動脈壁結(jié)構(gòu)變化；測量內(nèi)膜厚度（IT）和中膜厚度（MT），計算IT/MT比值；檢測血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）；酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）測定 血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP-1）、I型膠原C末端肽（CTX-1）。

結(jié)果：高脂+脂多糖組與其他三組比較，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)彈力板中斷甚至消失，內(nèi)膜下大量泡沫細胞、脂質(zhì)及炎細胞浸潤，可見多量平滑肌細胞，膠原沉積；中膜平滑肌細胞排列紊亂，中膜明顯萎縮。高脂+脂多糖組與其他三組比較，IT和IT/MT的比值均增加；進食高脂飼料8周后，高脂組、高脂+脂多糖組的血清高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平較對照組和脂多糖組均增高；進食高脂飼料16周后，高脂+脂多糖組較其他三組MMP-9、TIMP-1濃度明顯升高 ，脂多糖組、高脂+脂多糖組較對照組CTX-1顯著升高。上述比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

結(jié)論：高血脂和慢性炎癥反應(yīng)可能是動脈粥樣硬化(AS)和血管重塑的共同致病因素，在二者的交互作用下AS和血管重塑過程可以同時啟動和進展。

炎癥 ；動脈粥樣硬化； 血管平滑肌細胞；膠原C末端肽

Methods: The experimental rabbits were randomly divided into 4 groups. Normal control group, n=5, Hyperlipidaemia group, the animal received high fat diet, n=10, LPS group, the animal received LPS injection, n=10 and Hyperlipidaemia + LPS group, n=10. All animals were treated for 16 weeks. The arterial wall structure changes were observe by Masson stain method for tunica intima thickness (IT), media thickness (MT) and the ratio of IT/MT. The serum levels of HDL and LDL were examined. The serum levels of matrix metallo proteinase 9 (MMP-9), tissue inhibiter of matrix metallo protinase (TIMP-1) and C-terminel telopeptide of type I collagen (CTX-1) were detected by ELISA.

Results: Compared with the other 3 groups, Hyperlipidaemia + LPS group showed obviously thicker tunica intima, the inner elastic plate was interrupted or even disappeared, there were foam cells, lipid and inf l ammatory cells invasion, smooth muscle cell and collagen deposing under the intima. The media showed smooth muscle cell disorder and atrophy, the ratio of IT/MT increased. With 8 weeks treatment, Hyperlipidaemia and Hyperlipidaemia + LPS groups had signif i cantly increased HDL and LDL. With 16 weeks treatment, Hyperlipidaemia + LPS group had obviously elevated MMP-9 and TIMP-1. Compared with Normal control group, LPS and Hyperlipidaemia + LPS groups had elevated CTX-1. All P＜0.05.

Conclusion: Hyperlipidaemia and chronic inf l ammation might be the common pathogenic factors of atherosclerosis and vascular remodeling in experimental rabbits, the process could start and progress with their interaction.

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:466.)

近些年來，學者們發(fā)現(xiàn)，血管重塑在動脈粥樣硬化(AS)及一些心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用，還參與其他一些疾病的病理生理過程，管壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程至少包括細胞增生、細胞凋亡、細胞遷移及細胞外基質(zhì)合成降解等過程，血管除了能代償性擴張外，還可發(fā)生慢性收縮[1]。目前血管重塑的機制并不是很清楚，可能與血流動力學刺激、細胞外基質(zhì)改變、平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移及炎性反應(yīng)損傷等有關(guān)。血管重塑參與AS疾病的發(fā)生、發(fā)展、結(jié)局，并與血管成形術(shù)后再狹窄密切相關(guān)[2]。本實驗在建立高血脂和慢性感染模型的基礎(chǔ)上，探討了高血脂和慢性炎癥導致血管重塑的病生理機制。

1 材料和方法

材料：本實驗時間：2010-09至2013-09。膽固醇購自武漢諾輝酶制劑廠。脂多糖（LPS O55：B5）、弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司。高脂飼料的配制：1 %膽固醇、5 %豬油及94 %基礎(chǔ)飼料。血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP-1）、I型膠原C末端肽（CTX-1）、ELISA試劑盒均購自盒購自美國R&D System公司。Masson染液（麗春紅染液、0.5 %冰醋酸、1 %磷鉬酸、亮綠染液、蘇木素染液）由天津市胸科醫(yī)院病理科供。

動物分組及處理：35只8月齡雄性新西蘭大白兔（體重2.5～3.5kg，購自中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所實驗動物中心）。將實驗兔單籠飼養(yǎng)普通飼料1周，隨機分為4組：對照組（n= 5）、高脂組(n=10)、脂多糖組(n= 10)和高脂+脂多糖組 （n=10）。對照組和脂多糖組兔喂食普通飼料，150 mg/d，高脂組和高脂+脂多糖組兔喂食已制備好的高脂飼料，150 mg/d，所有動物均自由飲水，持續(xù)喂養(yǎng)至16周。脂多糖組和高脂+脂多糖組的實驗兔在4、8、12周，于背部皮下注射LPS乳化劑（0.5 mg/ml，弗氏完全佐劑和LPS按體積比1:1配制），采取小劑量多點注射的方法，每只兔注射LPS乳化劑總量為4 ml。四組實驗兔均飼養(yǎng)觀察至16周。各組兔分別于實驗開始、8周、12周及16周末處死前取血行血液生化檢測。于16周末取耳緣靜脈注射20%烏拉坦溶液后處死動物，剝?nèi)≈鲃用}弓起始部約2.0 cm動脈段，10 %中性甲醛液固定、包埋、切片。

檢測指標：Masson染色，利用病理圖像分析系統(tǒng)（HMIAS-2000型）攝片，觀察動脈壁結(jié)構(gòu)及成分變化，并測量內(nèi)膜厚度（IT）、中膜厚度（MT）和IT/ MT比值，每個切片均測量3次，取其平均值。檢測血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。ELISA法檢測血清MMP-9、TIMP-1、CTX-1。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，計量資料經(jīng)K-S檢驗證實均符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進行計算，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

四組實驗兔Masson染色主動脈壁結(jié)構(gòu)及成分的變化：Masson染色結(jié)果平滑肌細胞呈紅色，膠原纖維呈綠色。對照組主動脈壁各層結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜平整光滑，未見明顯泡沫細胞及炎細胞浸潤，內(nèi)彈力板完整，中膜平滑肌細胞排列整齊（圖1、圖2）。高脂組內(nèi)膜增厚，內(nèi)彈力板部分斷裂，內(nèi)膜下可見脂質(zhì)沉積、數(shù)層多量泡沫細胞、少量炎細胞浸潤，可見少量平滑肌細胞遷移、膠原纖維沉積；中膜平滑肌細胞排列較整齊，可見平滑肌細胞少量增生（圖3、圖4）。脂多糖組內(nèi)膜增厚，內(nèi)彈力板斷裂較高脂組增多，內(nèi)膜下亦可見脂質(zhì)沉積、多量泡沫細胞、炎性細胞浸潤，可見平滑肌細胞遷移，膠原纖維沉積；中膜平滑肌細胞排列較整齊，平滑肌細胞少量增生（圖5、圖6）。高脂+脂多糖組較其他三組內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)彈力板中段甚至消失，平滑肌細胞增生明顯，膠原沉積，中膜明顯萎縮（圖7、圖8）。

Masson染色分析高脂和脂多糖對四組實驗兔主動脈內(nèi)膜和中膜厚度的影響：高脂組、脂多糖組及高脂+脂多糖組與對照組比較，IT厚度和IT/MT的比值均增加，高脂+脂多糖組比對照組的MT厚度降低；高脂+脂多糖組與高脂組和脂多糖組比較，IT厚度和IT/MT的比值均增加，MT厚度降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表1

四組實驗兔血脂水平在不同時間點的變化比較：進食高脂飼料8周后，高脂組、高脂+脂多糖組的血清高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平較對照組和脂多糖組均增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表2

圖1～8 四組實驗兔Masson染色主動脈壁結(jié)構(gòu)及成分的變化

表1 Masson染色分析高脂和脂多糖對四組實驗兔主動脈內(nèi)膜和中膜厚度的影響

表1 Masson染色分析高脂和脂多糖對四組實驗兔主動脈內(nèi)膜和中膜厚度的影響

注：與對照組比較*P＜0.01；與高脂組比較△P＜0.05；與脂多糖組比較▲P＜0.05。IT：主動脈內(nèi)膜 MT：中膜厚度

對照組(n=5)高脂組(n=10)脂多糖組(n=10)高脂+脂多糖組(n=10) IT (μm) 7.92±1.44 70.47±2.22* 78.28±8.76*152.84±24.08*△▲MT (μm) 181.62±12.57 179.75±12.55 181.07±13.57 82.80±5.44*△▲IT/MT (%) 4.34±0.54 39.31±2.00* 43.36±4.99*184.22±23.38*△▲

表2 四組實驗兔血脂水平在不同時間點的變化比較（，mmol/L）

注：與對照組比較*P＜0.01；與脂多糖組比較△P＜0.01

對照組(n=5)高脂組(n=10)脂多糖組(n=10)高脂+脂多糖組(n=10)高密度脂蛋白膽固醇0周 0.52±0.08 0.47±0.12 0.48±0.10 0.49±0.13 8周 0.60±0.13 4.59±1.09*△ 0.54±0.20 4.20±1.56*△12周 0.49±0.14 5.43±1.52*△ 0.50±0.14 4.33±0.75*△16周 0.45±0.20 7.04±1.80*△ 0.45±0.19 5.15±0.61*△低密度脂蛋白膽固醇0周 0.62±0.11 0.47±0.11 0.47±1.19 0.50±0.11 8周 0.67±0.19 13.93±3.28*△ 0.65±0.20 13.25±3.02*△12周 0.89±0.26 15.52±2.59*△ 0.88±0.15 15.40±2.81*△16周 0.75±0.27 15.77±2.57*△ 0.63±0.22 16.80±1.45*△

表3 高脂和脂多糖對四組兔血清MMP-9、TIMP-1、CTX-1水平及MMP-9/TIMP-1比例的影響（，ng/ml）

表3 高脂和脂多糖對四組兔血清MMP-9、TIMP-1、CTX-1水平及MMP-9/TIMP-1比例的影響（，ng/ml）

注：與同期對照組比較*P＜0.05 ； 與同期高脂組比較△P＜0.05 ；與同期脂多糖組比較▲P＜0.05 ；與本組0周比較為＃P＜0.05。MMP-9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9 TIMP-1：基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑 CTX-1 ：I型膠原C末端肽

時間 MMP-9 TIMP-1 CTX-1 MMP-9/TIMP-1對照組(n=5) 0周 18.71±1.86 10.45±1.37 4.30±0.92 1.80±0.14 8周 19.88±2.22 11.25±1.27 4.57±0.67 1.77±0.13 12周 19.39±1.52 10.97±0.90 4.56±0.61 1.77±0.17 16周 20.13±2.05 10.84±1.23 4.47±0.75 1.87±0.22高脂組(n=10) 0周 20.06±1.57 10.67±1.01 4.65±0.74 1.89±0.11 8周 21.54±1.64 10.86±0.91 5.02±0.57 1.99±0.13*12周 23.10±1.43*＃ 11.12±0.74 5.26±0.92*＃ 2.08±0.10*＃16周 23.44±0.95*＃ 11.14±0.54 5.26±0.89*＃ 2.10±0.04*＃脂多糖組(n=10) 0周 19.22±2.29 10.26±0.94 4.82±0.59 1.87±0.10 8周 22.27±1.78*＃ 10.95±1.17 5.47±0.45*＃ 2.05±0.18*＃12周 24.44±3.33*＃ 11.51±1.43＃ 5.58±0.56*＃ 2.12±0.12*＃16周 25.56±1.00*＃ 11.79±0.53＃ 6.20±0.81*＃ 2.13±0.06*＃高脂+脂多糖組(n=10) 0周 19.99±1.01 10.46±0.42 4.82±0.42 1.91±0.05 8周 25.39±2.15*△＃ 12.09±0.13＃ 6.45±1.30*△＃ 2.10±0.20*12周 27.30±1.17*△＃ 12.65±0.96*＃ 7.17±0.51*△▲＃ 2.16±0.12*＃16周 31.66±3.01*△▲＃ 13.83±0.76*△▲＃ 7.35±0.64*△＃ 2.29±0.12*＃

高脂和脂多糖對四組實驗兔血清MMP-9、TIMP-1、CTX-1濃度及MMP-9/TIMP-1值的比較：高脂飼養(yǎng)8周后：高脂組與對照組同期比較，MMP-9濃度（12、16周） 、CTX-1濃度（12、16周）及MMP-9/TIMP-1（12、16周）均增加；高脂組與本組0周時比較，MMP-9濃度（12、16周）、CTX-1濃度（12、16周）及MMP-9/TIMP-1 （8、12、16周）均增加；脂多糖組與對照組同期及本組0周比較，MMP-9 濃度（8、12、16周）、TIMP-1濃度（高脂組12、16周）、CTX-1濃度（8、12、16周）及MMP-9/TIMP-1（8、12、16周）均增加；高脂+脂多糖組與對照組同期比較，MMP-9 濃度、TIMP-1濃度（12、16周）、CTX-1濃度及MMP-9/TIMP-1值均增加；高脂+脂多糖組與高脂組同期比較，MMP-9 濃度、TIMP-1濃度（16周）、CTX-1濃度均增加；高脂+脂多糖組與脂多糖組同期比較，MMP-9 濃度（16周）、TIMP-1濃度（16周）、CTX-1濃度（12周）均增加；高脂+脂多糖組與本組0周比較，MMP-9 濃度、TIMP-1濃度、CTX-1濃度及MMP-9/TIMP-1值（12、16周）均增加；差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表3

3 討論

流行病學資料提示，高血脂和慢性炎癥是AS的重要危險因素[3]。低密度脂蛋白(LDL)的升高與AS的發(fā)生呈正相關(guān)。AS斑塊中存在巨噬細胞、活化T細胞、肥大細胞等，感染和炎癥反應(yīng)是引起粥樣斑塊形成和不穩(wěn)定的因素[4,5]。近些年來，學者們發(fā)現(xiàn)，血管重塑在AS及一些心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用 。血管重塑是指血管腔面積及形態(tài)、血管壁結(jié)構(gòu)及成分、血管功能的慢性改變。目前血管重塑的機制并不是很清楚，部分研究認為與血流動力學刺激、細胞外基質(zhì)改變、平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移及炎性反應(yīng)損傷等有關(guān)[6,7]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在血管平滑肌細胞（VSMC）的遷移和基質(zhì)重構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用[8]：一方面VSMC增生遷移分泌大量的細胞外基質(zhì)；另一方面又產(chǎn)生MMPs，使基質(zhì)不斷降解。MMPs活性增強可促進動脈粥樣斑塊纖維帽中的基質(zhì)成分的降解，使纖維帽變薄，粥樣斑塊易發(fā)生破裂而并發(fā)血栓形成。 研究發(fā)現(xiàn)[9,10]，MMP-9等炎癥因子在動脈粥樣硬化組織中顯著高表達，進一步闡明了炎癥因子在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。TIMPs由與產(chǎn)生MMPs同樣的細胞合成、分泌，對所有的MMPs均具有抑制作用。但高血脂和慢性炎癥導致血管重塑的病生理過程尚需較為深入的探討。本研究發(fā)現(xiàn)，單純高血脂或慢性炎癥均可引起內(nèi)膜增厚,內(nèi)彈力板部分斷裂，內(nèi)膜下脂質(zhì)和膠原纖維沉積、泡沫細胞和炎細胞浸潤、少量平滑肌細胞遷移，中膜平滑肌細胞少量增生。這既是動脈粥樣硬化的病理表現(xiàn) ，也是血管重塑的病理學基礎(chǔ)。而慢性感染性炎癥反應(yīng)與高血脂相互作用加重了病理表現(xiàn)，而出現(xiàn)內(nèi)彈力板中斷甚至消失、中膜萎縮、平滑肌細胞排列紊亂，進而出現(xiàn)內(nèi)膜厚度與中膜厚度比例失衡。提示高血脂和慢性炎癥反應(yīng)可能是動脈粥樣硬化和血管重塑的共同致病因素，在二者的交互作用下動脈粥樣硬化和血管重塑過程可以同時啟動和進展。

脂代謝紊亂[11,12]時，低密度脂蛋白通過內(nèi)膜進入動脈內(nèi)皮下層被氧化修飾后可被巨噬細胞吞噬而變成泡沫細胞，釋放出大量膽固醇，氧化的低密度脂蛋白一方面可通過誘導內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增生、移行等促進血管重塑；另一方面可通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，促進細胞外基質(zhì)降解，從而促進血管重塑。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食早期即可引起低密度脂蛋白膽固醇的升高，且同步出現(xiàn)MMP-9升高，隨后逐漸緩慢出現(xiàn)MMP-9/TIMP-1比值、CTX-1的升高，而脂多糖刺激并不影響血清LDL水平。提示單純高血脂即可通過膠原降解而引發(fā)血管重塑的初始進程。

近年來研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)是動脈結(jié)構(gòu)與功能的重要影響因素[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥刺激可以不需要高血脂基礎(chǔ)而獨立誘導血清MMP-9、MMP-9/TIMP-1比值升高，出現(xiàn)膠原降解、CTX-1升高。在血脂升高時，慢性炎癥反應(yīng)在原有MMPs高表達的基礎(chǔ)上，進一步促進了脂質(zhì)的吞噬、氧化和細胞損傷過程，使MMPs分泌進一步增加，加速了膠原的降解和細胞的遷移、增殖、損傷、凋亡，從而導致血管重塑。

綜上所述，高血脂和慢性炎癥反應(yīng)可能是動脈粥樣硬化和血管重塑的共同致病因素，兩因素同時存在的情況下對機體的影響明顯增強，在二者的交互作用下動脈粥樣硬化和血管重塑過程可以同時啟動和進展。慢性炎癥反應(yīng)可通過影響膠原代謝促使血管重塑，進而促進AS的形成及進展。其可能機制為：炎癥反應(yīng)—炎細胞活化—釋放MMPs及炎癥因子—促使平滑肌細胞增殖、向內(nèi)膜遷移及表型轉(zhuǎn)化—加重炎癥反應(yīng)及進一步促進MMPs釋放—膠原合成降解失衡—血管重塑。移入內(nèi)膜的VSMC合成大量膠原纖維，使內(nèi)膜增厚構(gòu)成AS斑塊的重要成分，同時合成、分泌大量細胞因子及MMPs降解中膜膠原；隨著VSMC的遷移和凋亡，中膜VSMC減少，膠原合成減少，中膜萎縮變薄。提示我們在臨床上對于冠心病及其他動脈粥樣硬化疾病積極控制危險因素的同時，通過抑制炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)膠原代謝可能會成為今后防治AS的方法之一。

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Investigation of LPS Induced Arterial Vascular Remodeling in High Fat Diet Rabbits

HAN Qiong, LI Yan-yan, DU Fei, FENG Jin-ping.
Department of Cardiology, Tianjin Medical University, Tianjin (300051), China

Objective: To study the pathophysiological mechanism of arterial vascular remodeling in rabbits with hyperlipidaemia and chronic inf l ammation.

Inf l ammation; Atherosclerosis; Vascular smooth muscle cell; Collagen

2014-01-07）

（助理編輯：曹洪紅）

300051 天津市，天津醫(yī)科大學（韓瓊），天津胸科醫(yī)院 心內(nèi)科（李燕燕、杜菲、馮津萍）

韓瓊 主治醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病發(fā)病與炎癥反應(yīng)關(guān)系的研究 Email：hq991627qwert@163.com 通訊作者：馮津萍 Email：chlfjp@sina.com

R541

A

1000-3614（2014）06-0466-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.06.018