李正鵬，郭彪，李曉鷗，段育忠，王平，張宏文，周金蓮，崔彥，楊鶴鳴

隨著我國載人航天活動的日益頻繁和空間技術(shù)的迅速發(fā)展，對于失重狀態(tài)下航天員身體各系統(tǒng)器官病理生理變化的研究顯得愈加重要。失重狀態(tài)下，胃的節(jié)律運動功能及其消化液的極性運動必然受到影響，國內(nèi)外在這方面的研究報道相對較少[1-4]。本研究采用尾懸吊方法模擬失重環(huán)境，檢測微重力環(huán)境下大鼠胃竇肌層組織中誘生型環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2，Cox-2)、血清生長抑素(somatostatin，SS)及血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)水平的變化，探討失重狀態(tài)對大鼠胃竇動力學的影響，為航天員訓練和飛行的醫(yī)療保障提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準后進行動物實驗。采用清潔級健康成年雄性Wistar大鼠64只，體重200±20g，購自中國農(nóng)業(yè)大學實驗動物研究所。采用尾懸吊法建立模擬失重動物模型[5]。實驗步驟和組織采集過程參照前期文獻報道[6]。動物經(jīng)適應性飼養(yǎng)7d后進行實驗，采用隨機數(shù)表法將實驗動物隨機分為8組，分別為懸尾6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d和0h(對照)組(n=8)。各組懸吊結(jié)束前6h禁食水，稱量體重后腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)麻醉，無菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，顯露下腔靜脈并抽取血樣本，然后沿胃大彎剪開，縱行取腺胃胃竇區(qū)(包含幽門括約肌)組織，將黏膜層和肌層分離，分別保存于液氮中。另取縱行胃竇組織浸于4%多聚甲醛(pH 7.4)中固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 RT-PCR檢測大鼠胃竇肌層組織中Cox-2mRNA表達 根據(jù)GenBank設計引物序列。Cox-2：上游5'-AGACAGATTGCTGGCCGGGTTG-3'，下游5'-TTCAGGGAGAAGCGTTTGCGGT-3'，擴增片段長度137bp；GAPDH：上游5'-GGTTGTCTCCTGCG ACTTCA-3'，下游5'-GGGTGGTCCAGGGTTTCT TA-3'，擴增片段長度186bp。提取總RNA，測RNA濃度，采用Oligo(dT)合成cDNA第一條鏈行反轉(zhuǎn)錄，取2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA加至PCR反應體系中，上下游引物各0.4μl，反應總體積20μl。PCR反應條件為：94℃ 5min；95℃ 10s，57℃ 30s，72℃ 30s，37個循環(huán)；72℃延伸10min。采用AlphaImger 2200Soft ware電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描，分析各實驗組及對照組條帶的光密度(A)值及相應比值，計算各組Cox-2mRNA表達水平。

1.3 Western blotting檢測大鼠胃竇肌層組織Cox-2蛋白表達 取凍存胃竇肌層組織，在液氮預冷的研缽中研碎，加入組織裂解液(含蛋白酶抑制劑)，冰上放置20min，低溫下12000r/min離心15min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量。80V電泳1h后按電轉(zhuǎn)印標準方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，麗春紅染液染色，洗脫；采用TBST+5%脫脂奶粉溶液1:500稀釋一抗(美國Abcam)，4℃水平搖床過夜；采用TBST溶液洗膜10min×3次，加入用TBS溶液稀釋的生物素標記的羊抗兔二抗(1:5000，美國Zymed)，室溫搖床孵育2h，TBST洗膜10min×3次。分析免疫標記條帶的A值(AlphaImager 2200software)。

1.4 免疫組化檢測大鼠胃竇肌層組織中Cox-2蛋白表達 石蠟包埋胃竇組織后切片(厚5μm)，常規(guī)脫蠟水化；3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物，室溫下封閉內(nèi)源性過氧化物酶20min；將切片放入0.01mol/L pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液中，用微波加熱修復，繼用高火煮沸溶液，中火維持5min×4次，靜置至室溫，PBS溶液洗5min×3次；采用10%正常羊血清在室溫下孵育1h，加入1:200兔抗鼠Cox-2多克隆抗體(美國Abcam)，4℃孵育過夜；加入生物素標記的羊抗兔IgG(美國Zymed)，常溫下孵育2h，PBS洗滌5min×3次；滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(美國Zymed)，常溫下孵育2h，PBST洗滌5min×3次，PBS洗5min×3次；DAB顯色，復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下照相。Cox-2結(jié)果判定：以細胞核和(或)胞質(zhì)中有明顯的棕黃色顆粒為陽性。使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.5 血清SS和VIP水平測定 取血液標本，裝于滅菌離心管中，4℃過夜；3000r/min離心10min分離血清，所有操作均在冰上進行，–80℃保存。按SS和VIP放免試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)說明書操作，測定各組血清標本的放射性計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，正態(tài)分布及方差齊性檢驗后，多個樣本間的比較采用單因素方差分析，各模擬失重時相與正常對照(0h)之間均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗，多個均數(shù)之間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Cox-2mRNA的表達 模擬失重各組及對照組大鼠胃竇肌層組織中均有Cox-2mRNA表達。失重6h大鼠胃竇肌層組織中Cox-2mRNA的表達水平即出現(xiàn)顯著增高，12h、1d組仍呈高水平表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。大鼠胃竇肌層組織中Cox-2mRNA的表達從失重2d開始表達逐漸回落，3d、5d、7d組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1A)。

2.2 各組Cox-2蛋白的表達 Cox-2蛋白在各組大鼠胃竇肌層組織中均有不同程度表達，懸吊6h后Cox-2蛋白表達水平顯著升高，12h、1d組持續(xù)高表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，2、3、5、7d時Cox-2蛋白表達水平明顯下降，與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(圖1B)。

2.3 免疫組化染色觀察Cox-2蛋白表達 Cox-2蛋白陽性表達為棕褐色。對照組大鼠胃竇平滑肌部分胞質(zhì)染色呈弱陽性(圖2A、B)。懸吊6h、12h、1d大鼠胃竇平滑肌細胞胞質(zhì)染色加深，部分胞核染色亦呈陽性(圖2C、D)。懸吊2d后大鼠胃竇平滑肌胞核染色逐漸恢復，與對照組相似但染色略深(圖2E、F)。陰性對照平滑肌胞核及胞質(zhì)均未見著色(圖2G、H)。

圖1 模擬失重大鼠胃竇平滑肌Cox-2mRNA (A)和蛋白(B)的表達變化Fig.1Expression of Cox-2mRNA and protein in gastric antrum muscular layer of simulated weightlessness rats

2.4 血清SS、VIP水平測定結(jié)果 模擬失重大鼠血清SS水平在尾懸吊2～3d達峰值，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在尾懸吊6、12h階段，血清VIP水平明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著尾懸吊時間的延長，血清VIP水平呈逐漸下降趨勢，5d時又有一定程度上升，7d時VIP水平明顯高于對照組(P＜0.05，圖3)。

圖2 免疫組化染色觀察模擬失重大鼠胃竇平滑肌Cox-2的表達(DAB)Fig.2Expression of Cox-2protein in gastric antrum muscular layer of simulated weightlessness rats by immunohistochemistry (DAB)

3 討 論

胃維持正常生理功能主要依賴于自身3種不同類型的節(jié)律運動，并受胃腸肌電及多種神經(jīng)體液因素的影響。胃平滑肌細胞作為“壁內(nèi)神經(jīng)-ICC-平滑肌”這一基本運動模式的直接承受者，其特異性受體與胃腸激素及多種體液因子相結(jié)合進而調(diào)控胃平滑肌細胞的信號轉(zhuǎn)導，是影響胃動力的主要內(nèi)在因素[7-8]。

圖3 模擬失重大鼠血清SS、VIP水平變化Fig.3Changes of serum concentration of SS and VIP in simulated weightlessness rats

Cox是前列腺素(PGs)合成所必需的酶，也是PGs合成初始步驟中的關(guān)鍵限速酶。Cox有兩種同工酶，其中Cox-1為結(jié)構(gòu)型，被稱為要素酶、管家酶或生理性酶，Cox-2為誘導型，被稱為病理性酶[9]。Cox-2在胃黏膜層表達已有較多研究，結(jié)果顯示各種化學、物理和生物性損傷因素均能誘導其生成，進而催化PGs的合成，參與炎癥反應并促發(fā)胃黏膜癌變[10-12]。但關(guān)于Cox-2在胃平滑肌層的作用、機制及影響因素方面的研究目前仍比較局限[13]。

本實驗結(jié)果顯示，在尾懸吊模擬失重應激狀態(tài)下，大鼠胃竇平滑肌細胞的Cox-2表達發(fā)生了明顯變化，Cox-2mRNA及蛋白在早期即出現(xiàn)同步高表達，胃竇平滑肌細胞胞質(zhì)染色加深且出現(xiàn)部分核染色陽性。結(jié)合文獻分析認為，失重狀態(tài)本身作為一種不良刺激可誘導胃竇平滑肌細胞表達Cox-2，進而通過影響PGs合成等途徑上調(diào)細胞內(nèi)Ca2+濃度，使肌球蛋白輕鏈磷酸化水平升高，導致平滑肌收縮增強[8]。然而，失重狀態(tài)引發(fā)的是系列連鎖反應，而不僅僅是胃竇平滑肌細胞內(nèi)Cox-2的表達變化。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，尾懸吊模擬失重導致大鼠胃竇組織中c-kit mRNA及蛋白表達明顯下調(diào)，肌層Cajal間質(zhì)細胞(ICC-MY)染色減弱、連續(xù)性中斷，肌內(nèi)ICC-IM染色減弱的同時c-kit陽性ICC也明顯減少[6]。顯然，微重力因素的綜合效應可能使胃起搏電流和慢波產(chǎn)生紊亂，胃平滑肌節(jié)律運動失調(diào)，從而引發(fā)胃動力障礙。另外，鑒于Cox-2是一種炎性因子，亦不能排除其具有通過反饋性調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達從而完成損傷修復的功能。結(jié)合筆者前期研究發(fā)現(xiàn)隨著模擬失重時間的延長，Cox-2表達異?？奢^快恢復而Cajal間質(zhì)細胞的功能恢復較慢[6]，推測它們可能通過不同的通路進行自我調(diào)節(jié)并影響胃竇動力。

本實驗結(jié)果還顯示，隨著尾懸吊時間延長，胃竇Cox-2蛋白及mRNA表達雖有波動，但總體趨勢為向正常水平恢復，提示機體可能通過應激代償機制對模擬失重環(huán)境造成的反應和損傷進行修復并得以適應。同時我們也注意到，Cox-2表達經(jīng)過一定程度的恢復后，仍高于正常水平，表明尾懸吊模擬失重刺激的持續(xù)存在仍對胃竇動力有一定影響，這與本研究中血清SS、VIP的持續(xù)波動及筆者前期有關(guān)模擬失重條件下血漿胃動素持續(xù)明顯升高和Cajal間質(zhì)細胞狀態(tài)相吻合[5]。我們前期的研究結(jié)果還顯示，尾懸吊模擬失重可導致胃黏膜組織超微結(jié)構(gòu)改變，并伴隨胃黏膜組織中Cox-2表達明顯升高，Cox-2在胃黏膜失重應激反應過程中發(fā)揮重要作用[14]。阻斷對Cox-2的誘導或選擇性應用Cox-2抑制劑，可避免或減輕胃黏膜應激反應，并能維護胃平滑肌的節(jié)律運動，對其具體作用及機制有必要進一步深入探討。

腦腸肽是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道雙重分布的調(diào)節(jié)肽，也是影響胃動力的重要因素。SS作為一種重要的抑制性腦腸肽，可抑制胃腸腺體分泌和其他胃腸肽的釋放，同時可通過神經(jīng)內(nèi)分泌和旁分泌及抑制乙酰膽堿和其他胃腸激素的方式抑制胃腸運動[15-16]。VIP主要由胃腸道黏膜及肌層釋放，對胃腸平滑肌起直接抑制作用，可延緩胃排空，并能抑制胃酸和胃泌素的分泌[16-17]。本實驗結(jié)果顯示，大鼠血清SS濃度在尾懸吊模擬失重2～3d達峰值，其他各時間點濃度值波動明顯，未能明確其變化規(guī)律，可能與實驗時間短以及SS半衰期極短等因素有關(guān)。SS的這種變化可能源于機體對持續(xù)模擬失重條件下的應激性反應及適應性變化，同時也反映出胃腸運動調(diào)控的復雜性。本實驗結(jié)果還顯示，大鼠血清VIP濃度在尾懸吊模擬失重早期即顯著升高，其后經(jīng)過2～3d的回落后復又升高。這種變化的直接后果是抑制胃酸分泌和延緩胃排空。

上述實驗結(jié)果與文獻報道的人體臥床試驗和動物實驗結(jié)果基本一致[18-19]。從本實驗結(jié)果看，胃竇肌層Cox-2表達異常和血清SS及VIP濃度變化可能在大鼠胃竇失重性應激損傷及應激修復過程中發(fā)揮重要作用，對該變化的機制進行探討對失重訓練和航天飛行工作具有重要意義。

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