李勇，杜娟，余靜，王海燕，岳彩黎，曾靈，蔣建新

肺泡上皮(alveolar epithelium)由兩種細胞組成，即Ⅰ型肺泡上皮細胞(alveolar type Ⅰ cell，ATI)和Ⅱ型肺泡上皮細胞(alveolar type Ⅱ cell，ATⅡ)。傳統(tǒng)的觀點認為ATⅡ是肺泡上皮中具有生物學(xué)活性的細胞，而終末分化的ATI只是被動地參與氣血屏障的形成，不增殖，也不具有可塑性[1]。但最近的研究發(fā)現(xiàn)ATI可能不只是傳統(tǒng)意義上的終末分化細胞，而具有多樣的生物學(xué)功能，并在損傷修復(fù)過程中發(fā)揮一定作用[2]。雖然ATI數(shù)量只占全肺總細胞數(shù)的8%，但卻覆蓋了95%～98%的肺泡表面積[3]。ATI參與氣血屏障的形成，對于正常的換氣功能非常重要。由于ATI易破裂，缺少生物學(xué)標記，分離相對困難，因此目前針對ATI的研究主要采用由ATⅡ分化而來的ATI樣細胞，但其生物學(xué)特性與ATI細胞存在一定差異[4]。T1α是一種跨膜蛋白，研究表明其在肺臟中特異性表達于ATI細胞[5]，已廣泛應(yīng)用于ATI細胞的分離與鑒定[6-9]。本研究的目的是改良細胞分離方法，利用酶消化法、IgG貼壁法和免疫磁珠技術(shù)等分離得到高純度的原代ATI，并初步觀察其生物學(xué)特性，為研究以ATI損傷為特征的肺部疾病提供可靠的體外模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體重約120g，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0005，使用許可證號SYXK(渝)2012-0010。

1.2 主要試劑及儀器 EDTA、EGTA、DAPI(Sigma公司)，Dispase(BD公司)，DNase Ⅰ、兔抗大鼠Podoplanin多克隆抗體(Sigma-Aldrich公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，大鼠IgG(中杉金橋公司)，磁珠包被的抗兔IgG(Miltenyi Biotec公司)，山羊抗大鼠小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)多克隆抗體、兔抗大鼠水通道蛋白5(AQP5)多克隆抗體、兔抗大鼠Ki67(Abcam公司)，兔抗大鼠表面活性蛋白C前體(pro-SPC)多克隆抗體(Millipore公司)，驢抗山羊IgG/AF549、驢抗兔IgG/AF488(Invitrogen公司)，山羊抗兔IgG/TRITC(中杉金橋公司)，正常驢血清(Jackson公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，倒置顯微鏡(Leica公司)，活細胞工作站(API公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 肺臟單細胞懸液的制備 大鼠稱重、麻醉，全身肝素化，采用無菌PBS(含50U/ml肝素)灌肺至完全變白；用37℃預(yù)熱的PBS(pH7.4，5mmol/L EGTA，5mmol/L EDTA)灌洗肺泡腔3次；向肺中灌入10ml預(yù)熱的Dispase(10U/ml)，37℃消化40min，其間配合機械搖動；消化完畢后保留肺葉，加入1ml分散液(RPMI 1640培養(yǎng)基，20% FBS，100μg/ml DNase Ⅰ)，充分剪碎；用100μm濾網(wǎng)過濾1次、40μm濾網(wǎng)過濾2次后收集濾液，離心棄上清，重懸細胞沉淀，獲得單細胞懸液。

1.3.2 ATI的純化 將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中，37℃孵育60min。收集未貼壁細胞，離心后重懸于0.5ml 抗體孵育液中(RPMI 1640培養(yǎng)基，1%FBS，50μg/ml DNase Ⅰ)；加入5μg兔抗大鼠T1α，4℃搖床上孵育35min，用PBS(pH7.2，0.5%BSA，2mmol/L EDTA)漂洗2次，將細胞離心后重懸于80μl抗體孵育液中，加入20μl磁珠標記的山羊抗兔IgG，4℃孵育15min；用PBS(pH7.2，0.5%BSA，2mmol/L EDTA)漂洗1次后過分選柱2次；用PBS(pH7.2，0.5%BSA，2mmol/L EDTA)漂洗4次，每次0.5ml；取出分選柱，收集陽性細胞。取少量進行細胞計數(shù)和臺盼藍染色判斷活力。

1.3.3 ATI的培養(yǎng) 細胞以2×104/cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，加入高糖DMEM培養(yǎng)基、10%FBS、100μg/ml青霉素和鏈霉素，在5%CO2、37℃恒溫育箱中孵育。

1.3.4 ATI的純度鑒定 計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml，細胞爬片，次日將玻片放在丙酮溶液中并置于冰上固定15min，10%山羊血清37℃封閉1h，加入驢抗山羊IgG/AF549(1:400)，37℃避光孵育1h，DAPI染核，封片，觀察并采集熒光。鏡下隨機視野計數(shù)細胞，計算陽性細胞百分比。

1.3.5 ATI表型鑒定 取培養(yǎng)5d的ATI細胞爬片放在丙酮溶液中并置于冰上固定，10%山羊血清封閉，實驗組加入一抗(山羊抗大鼠Caveolin-1多克隆抗體，工作濃度1:100；兔抗大鼠AQP5多克隆抗體，工作濃度1:400；兔抗大鼠proSPC多克隆抗體，工作濃度1:1000；兔抗大鼠Ki67抗體，工作濃度1:200)孵育液，對照組加等量PBS，4℃過夜孵育，次日在37℃孵箱中復(fù)溫；加入二抗(驢抗山羊IgG/AF594，工作濃度1:400；山羊抗兔IgG/TRITC，工作濃度1:200；驢抗兔IgG/AF488，工作濃度1:400；驢抗兔IgG/AF488，工作濃度1:400)孵育液，37℃避光孵育，DAPI染核。

1.3.6 生長曲線的繪制 取原代分離的ATI接種于12孔板，每孔2×104個細胞，共接種2板。48h后開始計數(shù)，以后每隔48h計數(shù)1次，每次計數(shù)3孔，計算平均值和標準差。具體計數(shù)方法：吸棄培養(yǎng)孔的培養(yǎng)基，PBS漂洗2次，加入0.5ml預(yù)熱的0.25%胰酶，37℃消化5～7min，其間輕拍孔底數(shù)次，待鏡下觀察見全部細胞懸浮后，將細胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，1000r/min離心5min，棄上清，用100μl PBS重懸細胞，充分混勻，取10μl細胞計數(shù)，數(shù)4個大格中的細胞總數(shù)。每孔的細胞數(shù)=(4大格細胞總數(shù)/4)×104×0.1。

2 結(jié) 果

2.1 ATI的產(chǎn)量及活力 每只體重120g左右的SD雄性大鼠可分離獲得的ATI細胞數(shù)為(2.1±0.5)×106個，臺盼藍染色顯示其活力為93.8%±1.6%。

2.2 ATI純度鑒定 分離出細胞后進行細胞爬片，免疫熒光染色檢測其T1α的表達，結(jié)果顯示其陽性率為91.0%±0.6%(圖1A–C)，分選陰性細胞不表達T1α(圖1D)。

2.3 ATI的生物學(xué)特性

2.3.1 ATI的生長規(guī)律 倒置顯微鏡觀察細胞的生長規(guī)律，培養(yǎng)1d時，細胞貼壁但是仍然保持圓形以及致密狀(圖2A)。培養(yǎng)3d時，ATI完全貼壁、伸展，出現(xiàn)偽足(圖2B)，包括板狀偽足和絲狀偽足。培養(yǎng)7d時，細胞匯合形成單層扁平狀，形態(tài)多樣，呈多邊形、類圓形、梭形(圖2C)。

2.3.2 ATI表型檢測 培養(yǎng)5d的細胞呈單層扁平狀，呈多邊形，免疫熒光染色顯示Cav-1、AQP5陽性，pro-SPC陰性(圖3)。

圖1 細胞純度的鑒定(DAPI ×200)Fig. 1 Purity identification of alveolar type Ⅰ cells (DAPI ×200)

圖2 原代培養(yǎng)ATI的形態(tài)(倒置顯微鏡 ×200)Fig. 2 Morphology of primary cultured alveolar type Ⅰ cells (Inverted microscope ×200)

圖3 原代培養(yǎng)ATI的表型(DAPI ×600)Fig. 3 Phenotype of primary cultured alveolar type Ⅰ cells (DAPI ×600)

2.3.3 ATI的增殖能力 接種第1～3天，細胞貼壁、伸展，數(shù)量較穩(wěn)定，從第4天開始，細胞生長加速，約第8天開始進入對數(shù)增長期，對數(shù)增長期細胞倍增時間約為66h，直至第12天細胞出現(xiàn)接觸抑制、增殖減慢。體外培養(yǎng)的細胞生長曲線見圖4。免疫熒光檢測顯示，體外培養(yǎng)的ATI表達增殖相關(guān)抗原Ki67，表明其能夠體外增殖。

3 討 論

肺臟是一個具有多重組織結(jié)構(gòu)的復(fù)雜的分支器官，由來自內(nèi)胚層和中胚層的多種細胞組成，據(jù)估計含有40～60種細胞[10]。肺臟由于其獨特的解剖結(jié)構(gòu)及與外界相通的特征，是各種危重疾病時最易受累的靶器官，如在嚴重創(chuàng)傷時易出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury，ALI)[11]。肺損傷后修復(fù)的關(guān)鍵之一是肺泡上皮的修復(fù)，既往相關(guān)研究主要關(guān)注于ATⅡ，但近年發(fā)現(xiàn)ATI可能不只是傳統(tǒng)意義上的終末分化細胞，同時還具有多種生物學(xué)功能[2]。Yamamoto等[12]研究發(fā)現(xiàn)在肺炎球菌引起的肺炎中ATI參與了固有免疫反應(yīng)。Wong等[13]研究發(fā)現(xiàn)采用LPS刺激ATI細胞能夠產(chǎn)生細胞因子，且該效應(yīng)受腎素-血管緊張素系統(tǒng)調(diào)節(jié)。以上研究表明ATI除了傳統(tǒng)的對水和離子的轉(zhuǎn)運功能外，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。因此，分離出高純度的ATI對以其損傷為特征的肺部疾病的體外研究具有重要意義。

圖4 ATI生長曲線Fig. 4 Growth curve of primary cultured alveolar type Ⅰ cells

本研究參照已報道的分離純化ATI的方法[6-9]，并結(jié)合實際情況進行了改良。首先，關(guān)于實驗動物的選擇，各實驗室差別較大，所用動物體重從100～300g不等，本研究選擇120g左右的SD大鼠，因為該體重大鼠肺泡已經(jīng)發(fā)育成熟[14]，且肺部質(zhì)量較好。第二，關(guān)于消化酶的選擇，目前國內(nèi)文獻分離肺泡上皮細胞多采用胰蛋白酶，國外文獻通常采用彈性蛋白酶。胰酶消化后獲取的細胞特異性不強，且對細胞損傷較大，彈性蛋白酶雖然對上皮具有一定特異性，對細胞損傷較小，但是價格昂貴，不易獲得。本研究采用的中性蛋白酶又稱分散酶，是一種非特異性的金屬蛋白酶，作用迅速有效且溫和，能保持細胞的完整性，對細胞膜無損傷，同時該酶為非哺乳動物來源，無被支原體或動物病毒污染的風(fēng)險，對溫度、pH改變以及血清成分都很穩(wěn)定，已被廣泛應(yīng)用于肺臟干/祖細胞的分離。第三，在純化步驟中，采用大鼠IgG貼壁篩選去除細胞膜上具有Fc片段的免疫細胞(主要是巨噬細胞)，因為部分巨噬細胞和其他免疫細胞亞群也表達ATI特異性標志物T1α[15]；貼壁時間選擇60min，因為時間過長ATI細胞也會貼壁[11]。第四，在分選步驟中，以T1α作為特異性標志物，通過磁珠分選獲得高純度的ATI，與流式分選相比，該方法的操作相對簡單，分離時間短，對細胞的損傷小，獲得細胞的活力好。

本研究通過倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況、采用免疫熒光檢測其特異性蛋白的表達、繪制細胞生長曲線了解所獲ATI的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，ATI細胞呈集落樣生長，胞質(zhì)豐富，培養(yǎng)7d后匯合形成單層扁平樣細胞。免疫熒光檢測時選擇T1α[15]、AQP5[16]、Caveolin-1[17]作為陽性標志物，因為它們在肺臟中特異性表達于ATI。T1α是一種高度保守的跨膜蛋白，在正常組織和腫瘤中均可表達，對心臟、肺、淋巴系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用[5,15]。AQP5是水通道蛋白的一個亞群，參與水的代謝[16]，免疫熒光染色可見其在胞膜上有一定聚集現(xiàn)象，與文獻報道一致[6,9]，但是具體原因目前尚不清楚，可能與AT1細胞的功能相關(guān)，因為AT1細胞參與氣血屏障的形成，在水和離子轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。Caveolin-1是膜整合蛋白，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膽固醇代謝、細胞內(nèi)化及腫瘤轉(zhuǎn)移、肌細胞合成等方面具有重要作用[17]。生長曲線顯示ATI和傳統(tǒng)意義上的終末分化細胞不同，在體外能夠增殖，對數(shù)生長期的倍增時間約為66h。

綜上所述，本實驗通過改良單細胞制備及分選操作從成年大鼠肺臟中分離出了純度較高的ATI，并初步觀察了其生物學(xué)特性，培養(yǎng)后細胞生長良好，可以為后續(xù)以ATI損傷為特征的肺部疾病的研究提供可靠的體外模型。

[1]Weibel ER. A note on differentiation and divisibility of alveolar epithelial cells[J]. Chest, 1974, 65(Suppl): 19S-21S.

[2]Zea B, Edward DC. More life for a "terminal" cell[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2009, 297(6): L1042-L1044.

[3]Stone KC, Mercer RR, Gehr P, et al. Allometric relationships of cell numbers and size in the mammalian lung[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1992, 6(2): 235-243.

[4]Dobbs LG, Johnson MD, Vanderbilt J, et al. The great big alveolar TI cell: evolving concepts and paradigms[J]. Cell Physiol Biochem, 2010, 25(1): 55-62.

[5]Williams MC, Cao Y, Hinds A, et al. T1 alpha protein is developmentally regulated and expressed by alveolar type I cells,choroid plexus, and ciliary epithelia of adult rats[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996, 14(6): 577-585.

[6]Wang S, Hubmayr RD. Type I alveolar epithelial phenotype in primary culture[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 44(5):692-699.

[7]Randell SH, Fulcher ML. Epithelial cell culture protocols[M]. 2nd ed. London: Springer Science Business Media, 2013. 145-159.

[8]Chen J, Chen Z, Narasaraju T, et al. Isolation of highly pure alveolar epithelial type I and type II cells from rat lungs[J]. Lab Invest, 2004, 84(6): 727-735.

[9]Downs CA, Montgomery DW, Merkle CJ. Cell culture models using rat primary alveolar type I cells[J]. Pulm Pharmacol Ther,2011, 24(5): 577-586.

[10]Bertoncello I, McQualter JL. Endogenous lung stem cells: what is their potential for use in regenerative medicine[J]? Respir Med, 2010, 4(3): 349-362.

[11]Thompson BT, Moss M. A new definition for the acute respiratory distress syndrome[J]. Semin Respir Crit Care Med,2013, 34(4): 441-447.

[12]Yamamoto K, Ferrari JD, Cao Y, et al. Type I alveolar epithelial cells mount innate immune responses during pneumococcal pneumonia[J]. J Immunol, 2012, 189(5): 2450-2459.

[13]Wong MH, Chapin OC, Johnson MD. LPS-stimulated cytokine production in type I cells is modulated by the renin-angiotensin system[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2012, 46(5): 641-650.

[14]Ornitz DM, Yin Y. Signaling networks regulating development of the lower respiratory tract[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol,2012, 4(5): a008318.

[15]Astarita JL, Acton SE, Turley SJ. Podoplanin: emerging functions in development, the immune system, and cancer[J]. Front Immunol, 2012, 3: 283.

[16]Borok Z, Lubman RL, Danto SI, et al. Keratinocyte growth factor modulates alveolar epithelial cell phenotype in vitro: expression of aquaporin 5[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998, 18(4): 554-561.

[17]Newman GR, Campbell L, von Ruhland C, et al. Caveolin and its cellular and subcellular immunolocalisation in lung alveolar epithelium: implications for alveolar epithelial type I cell function[J]. Cell Tissue Res, 1999, 295(1): 111-120.