易東升，林 琳，高 峰

(1.大連市第二人民醫(yī)院 骨外科，遼寧 大連116001;2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連116044 )

1965年，Urist［1］將動(dòng)物脫鈣的骨基質(zhì)種植于動(dòng)物肌袋內(nèi)，發(fā)現(xiàn)種植部位有大量軟骨和骨組織生成，并發(fā)現(xiàn)其中一種具有誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化成骨的蛋白，此后這種蛋白被命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)。目前，通過基因重組的方法已獲得20 余種BMPs，這些BMPs均能誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化，對(duì)成骨細(xì)胞及其他骨組織工程種子細(xì)胞也有同樣的誘導(dǎo)作用，其中BMP -2 和BMP -7 是研究最廣泛，誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的兩種BMPs，這兩種BMPs在骨發(fā)生、誘導(dǎo)、修復(fù)和骨量保持方面發(fā)揮著重要而關(guān)鍵的作用。但是，在BMPs 的實(shí)驗(yàn)研究中最多見的是關(guān)于單獨(dú)應(yīng)用BMP-2 和BMP -7 對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性影響的報(bào)道，而聯(lián)合應(yīng)用BMP -2 和BMP-7 對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)對(duì)制備的大鼠乳鼠成骨細(xì)胞，聯(lián)合應(yīng)用BMP -2 和BMP-7，探討聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)大鼠乳鼠成骨細(xì)胞生物學(xué)活性影響，以便進(jìn)一步為臨床上治療骨缺損，骨折不愈合，促進(jìn)骨折愈合和椎體融合提供理想的移植細(xì)胞。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑儀器

出生5日齡的SD 大鼠4 只(雌雄不限):由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):SCXK(遼)2008 -0002;胎牛血清:杭州四季清生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、MTT:上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡:重慶光學(xué)儀器廠;CO2孵育箱:英國(guó)Thermo 公司;BMP -2 和BMP-7(Rehovot Science Park);堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所);骨鈣素放射免疫分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司);MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司);12 孔，24 孔培養(yǎng)板，25 cm2培養(yǎng)瓶(Nunc 公司);二甲基亞颯(天津登峰化學(xué)試劑廠);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(MRX-II 型，美國(guó)Dynex 公司);CO2孵育箱(英國(guó)Thermo 公司)。

1.2 原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法

1.2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng):將5日齡的SD 乳鼠4 只放入750 mL/L 乙醇中浸泡10 min，無(wú)菌取顱蓋骨，置于含PBS 液的培養(yǎng)皿中，盡量剔除附著的血管及結(jié)締組織，加入適量2.5 g/L 的胰蛋白酶，于37 ℃氣浴振蕩，預(yù)消化20 min，終止消化，PBS 液清洗。再將顱蓋骨剪成1 mm ×1 mm 碎塊，加入適量1.0 g/L 的Ⅱ型膠原酶，37 ℃氣浴振蕩消化1 h，終止消化，液體移入另一離心管，1 500 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀即為成骨細(xì)胞。用含100 mL/L 胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液重懸，吹打均勻，接種至培養(yǎng)瓶，37 ℃50 mL/L CO2飽和濕度下培養(yǎng)24 h 后換液，以后每3 d 換液1 次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用2.5 g/L 的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 成骨細(xì)胞的傳代:吸掉以前的培養(yǎng)液;用PBS 液洗滌細(xì)胞1 ～2 次;加入胰酶溶液(1 mL/25 cm2、2 mL/75cm2)37 ℃作用數(shù)分鐘，于倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉胰酶溶液;輕拍培養(yǎng)瓶使細(xì)胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊。混合均勻后，依稀釋比例(1∶2)轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)，以每孔9 ×104接種到預(yù)先放有無(wú)菌蓋玻片的24 孔培養(yǎng)板，并以每孔4.8 ×103接種到96 孔培養(yǎng)板中。

1.2.3 活細(xì)胞的觀察檢測(cè):臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)細(xì)胞成活率:取1 滴5 g/L 的臺(tái)盼藍(lán)染液(取0.5 g 臺(tái)盼藍(lán)充分溶于50 mL 的雙蒸水中，濾紙過濾，再加入18 g/L的NaCl 溶液至100 mL)與9 滴細(xì)胞懸液混合后，滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，靜置2 min 后，在顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，重復(fù)2 次，未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞的百分率。

倒置相差顯微鏡觀察:原代培養(yǎng)至細(xì)胞匯合后傳代，進(jìn)行觀察拍片。

噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力:在測(cè)定前4 h取出1 塊96 孔板，更換成無(wú)血清的α -MEM 培養(yǎng)液100 μL(含10 μL 5 g/L 的MTT)，培養(yǎng)箱孵育4 h，加100 μL 無(wú)水乙醇，振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上讀取D490nm 值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3 分組及各組處理方法

采用本實(shí)驗(yàn)制備和培養(yǎng)的大鼠乳鼠成骨細(xì)胞，以下實(shí)驗(yàn)中所用的細(xì)胞均為第3 ～5 代細(xì)胞。傳代細(xì)胞的培養(yǎng)板孔中加有消毒蓋玻片，制備細(xì)胞爬片。將傳代細(xì)胞(3 ～5 代)按6.0 ×104/mL 接種于96 孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液。并將其分為單獨(dú)應(yīng)用BMP -2 組和單獨(dú)應(yīng)用BMP -7組，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 組，對(duì)照組不加任何處理因素(每組3 孔)，48 h 后，加入15 μL 5.0g/LMTT(新鮮配制)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄培養(yǎng)液，每孔加150 μL 的二甲基亞砜，振蕩，室溫10 min，570 nm 下測(cè)定A 值。

取生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)細(xì)胞，用胰酶消化，計(jì)數(shù)，按2.0 ×104/mL 接種于24 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，加入用無(wú)血清的α -MEM稀釋的BMP(單獨(dú)應(yīng)用BMP-2 和BMP -7，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP -7)，對(duì)照組僅加培養(yǎng)液。48 h后收集細(xì)胞裂解液，檢測(cè)ALP 活性，OCN 含量和總蛋白含量(每組3 孔)。細(xì)胞裂解液中總蛋白含量測(cè)定用Pierce 公司的BCA(Bicinchininic acid)試劑盒，按試劑說明進(jìn)行測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 細(xì)胞裂解液(加入TritonX -100 過夜)中堿性磷酸酶活性測(cè)定:采用磷酸對(duì)硝基苯醋二鈉鹽為底物，405 nm 波長(zhǎng)比色，測(cè)定吸光度值，換算成國(guó)際單位，以IU/L·mg 蛋白表示ALP 活性，蛋白含量的測(cè)定用BCA 法(Pierce 公司試劑盒)。

1.4.2 OCN 含量檢測(cè):OCN 含量檢測(cè)用放射免疫法(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科)，用ng/L·mg 蛋白表示細(xì)胞裂解液中OCN 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞成活率

膠原酶消化的原代細(xì)胞成活率88.69%;待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶消化傳代的細(xì)胞成活率94.12%。

2.2 MTT 法繪制生長(zhǎng)曲線

用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力的結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞在接種后第4 ～5 天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第10 天達(dá)到生長(zhǎng)峰值，此后進(jìn)入生長(zhǎng)衰減期(見圖1)。

圖1 成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線Fig 1 The growth curve of osteoblasts

2.3 原代及傳代培養(yǎng)成骨細(xì)胞的生物學(xué)特征

用膠原酶消化下來的成骨細(xì)胞接種培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下可見貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣外觀，為不規(guī)則梭形，三角形或多角形，有較多突起，部分細(xì)長(zhǎng)突起?？缭郊?xì)胞與遠(yuǎn)處的細(xì)胞突起相連接，胞核呈圓形或橢圓形，居中或偏于一側(cè)，輪廓清晰，可見1 ～3 個(gè)核仁(圖2A)。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁時(shí)，細(xì)胞多呈梭形或立方形，排列緊密。繼續(xù)進(jìn)行傳代，以每孔9 ×104接種到24 孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞大部分匯合后，換成成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液，培養(yǎng)至第6 天細(xì)胞重疊生長(zhǎng)，開始形成細(xì)胞團(tuán)塊，第10 天可見鈣化結(jié)節(jié)形成，第17 天可見多個(gè)鈣化結(jié)節(jié)融合在一起。

2.4 ALP 染色的光鏡觀察

用NBT/BCIP 染色試劑盒染色的結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞呈藍(lán)色，且顏色深淺不等，功能活躍細(xì)胞著色較深，功能不活躍的細(xì)胞著色較淺(圖2B)。Gomori改良鈣-鈷法染色的結(jié)果顯示，成骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色顆粒或塊狀沉淀(圖2C)。且ALP 染色陽(yáng)性率為98.06%。

2.5 礦化結(jié)節(jié)的光鏡觀察

用倒置相差顯微鏡觀察成骨細(xì)胞，可見多個(gè)大小不等的礦化結(jié)節(jié)(圖2D)，茜素紅染色時(shí)礦化結(jié)節(jié)紅染，有的多個(gè)礦化結(jié)節(jié)融合(圖2E)，四環(huán)素標(biāo)記后用熒光顯微鏡觀察，礦化結(jié)節(jié)呈綠色(圖2F)。

2.6 BMP 對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響

聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7，單獨(dú)應(yīng)用BMP-2 和BMP-7，不應(yīng)用BMP-2 和BMP -7(對(duì)照組)處理成骨細(xì)胞48 h 后，成骨細(xì)胞增殖(MTT 法)，ALP 活性和OCN 含量檢測(cè)結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用BMP -2 和BMP -7，48 h后，均能刺激大鼠乳鼠成骨細(xì)胞的增殖，增加成骨細(xì)胞ALP 活性和OCN 含量，但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性意義(P ＞0.05)。但聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 后對(duì)大鼠乳鼠成骨細(xì)胞的增殖，增加成骨細(xì)胞ALP活性和OCN 含量較對(duì)照組，單獨(dú)應(yīng)用BMP -2 和BMP-7 組比較差異有顯著性意義(P ＜0.05)。

3 討 論

BMP(bone morphogenetic protein)最早定義為在骨骼外的部位能誘導(dǎo)骨形成的蛋白質(zhì)［2］，它屬于轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子- β(transforming growth factor - β，TGF-β)超家族成員?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)有20 多種BMPs，在形態(tài)發(fā)生和胚胎形成的過程中BMPs 影響骨、軟骨及骨骼的形成［2-3］。

圖2 貼壁生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞及鑒定觀察Fig 2 Identification observe about the growth of osteoblasts

表1 BMP 對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響Tab 1 BMP effects on osteoblast proliferation and differentiation ( ± s)

表1 BMP 對(duì)成骨細(xì)胞增殖和分化的影響Tab 1 BMP effects on osteoblast proliferation and differentiation ( ± s)

1)與對(duì)照組、BMP-2 組和BMP-7 組比較，P ＜0.05

組別 MTT(A 值) ALP/TP(IU/L·mg 蛋白) OCN/TP(ng/L·mg 蛋白)對(duì)照組0.337 ±0.004 0.350 ±0.087 7.077 ±0.472 BMP-2 組 0.369 ±0.006 0.400 ±0.044 9.330 ±1.211 BMP-7 組 0.447 ±0.005 1.203 ±0.293 9.410 ±2.104聯(lián)合應(yīng)用組 0.750 ±0.0031) 1.301 ±0.0231) 10.417 ±2.2201)

BMP-2 作為TGF-β 超家族成員，具有很強(qiáng)的促進(jìn)成骨的功能。有研究報(bào)道了BMP-2 對(duì)人未成熟成骨細(xì)胞前體細(xì)胞——新生兒顱骨細(xì)胞(human neonetal calvariacells，HNC)的短期(48 h)和長(zhǎng)期(3周)作用，發(fā)現(xiàn)BMP-2(0.1 ～100 ng/mL)無(wú)論在短期還是長(zhǎng)期的培養(yǎng)中都抑制HNC 細(xì)胞的增殖，48 h時(shí)，ALP 活性明顯增加，但OCN 含量并無(wú)明顯變化。3 周時(shí)，ALP 活性，OCN 含量，鈣沉積都明顯增加［4］。本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型來源于大鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞，BMP-2 作用48 h 后，成骨細(xì)胞的增殖，成骨細(xì)胞ALP 活性和OCN 含量都有所增加，但與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性意義。本研究中并未涉及到BMP-2 對(duì)成人成骨細(xì)胞的長(zhǎng)期作用，但目前的結(jié)果至少可以說明來源于新生兒顱骨的成骨細(xì)胞和來源于大鼠乳鼠顱骨的成骨細(xì)胞對(duì)BMP-2 的反應(yīng)并不一致，后者BMP-2 作用48 h 后，OCN 含量已明顯增加，而前者并無(wú)明顯變化，提示兩者可能在分化程度上不同。

骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)具有較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)能力，是骨形成蛋白家族中誘導(dǎo)成骨能力最強(qiáng)的生長(zhǎng)因子之一。BMP -7分布范圍極其廣泛，主要存在于骨，體外實(shí)驗(yàn)為在體實(shí)驗(yàn)提供了佐證與理論支持。Gu 等［5］在鼠成肌細(xì)胞的前體細(xì)胞C2C12 培養(yǎng)液中添加BMP -7，結(jié)果可引起該細(xì)胞由成肌細(xì)胞分化途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞途徑。當(dāng)BMP-7 濃度在200 μg/L 時(shí)，可完全抑制肌小管形成并強(qiáng)烈誘導(dǎo)堿性磷酸酶(ALP)活性，與未處理的對(duì)照組相比其ALP 活性升高20 倍。骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子Runx2/Cbfa1 是成骨細(xì)胞分化的分子開關(guān)，其mRNA 水平在BMP-7 處理24 h 達(dá)到高峰，升高達(dá)6 倍。另外，BMP -7 還可使骨鈣素mRNA 水平升高55 倍，本實(shí)驗(yàn)中BMP -7 雖然對(duì)成骨細(xì)胞的增殖，成骨細(xì)胞ALP 活性和OCN 含量有所增加，但同單獨(dú)使用BMP-2 效果一致。

ALP 是成骨細(xì)胞分化的早期指標(biāo)，其表達(dá)隨著細(xì)胞分化的發(fā)展而增強(qiáng)，其作用是水解有機(jī)磷酸釋放出無(wú)機(jī)磷而用于羥磷灰石的形成，是骨形成所必需的酶，它的表達(dá)代表著骨形成的狀況［6］。ALP 的表達(dá)緊接著細(xì)胞增殖的下調(diào)，代表著細(xì)胞分化的開始［7］。骨鈣素作為成骨細(xì)胞分化的中期指標(biāo)，有學(xué)者認(rèn)為，骨鈣素在維持正常礦化率和抑制軟骨的礦化中起作用［8］，當(dāng)骨形成和骨吸收解偶聯(lián)時(shí)，骨鈣素是反映骨形成的特異指標(biāo)，而這3 項(xiàng)指標(biāo)(細(xì)胞的增殖，ALP 活性，骨鈣素含量)是檢測(cè)成骨細(xì)胞生物學(xué)活性的標(biāo)志性指標(biāo)。研究結(jié)果表明，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 作用大鼠乳鼠成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的增殖MTT(A值)，成骨細(xì)胞ALP 活性，骨鈣素含量都較對(duì)照組，BMP-2 組，BMP -7 組有了明顯的增加(P ＜0.05)。結(jié)果可能與BMP 的生物學(xué)活性有關(guān)，BMP 本身就有誘導(dǎo)成骨細(xì)胞形成的作用。而其更重要的意義在于:BMP 在骨的發(fā)生與修復(fù)過程中具有重要作用，因而BMP 在骨科的疾病治療中具有十分廣闊的應(yīng)用前景，BMP 具有治療大塊骨缺損以及骨不連的功能。除治療骨缺損和骨不連外，臨床上將BMP 用于脊柱融合也取得了很好的療效，Cook SD 等［9］將BMP 作為骨移植的替代物用于椎體融合，結(jié)果顯示融合效果良好，且與自體骨移植相比，融合速度更快，融合后脊柱的生物力學(xué)穩(wěn)定性更佳。

聯(lián)合應(yīng)用BMP -2 和BMP -7 刺激成骨細(xì)胞后，使成骨細(xì)胞生物學(xué)活性得到顯著增強(qiáng)，使得聯(lián)合應(yīng)用BMP-2 和BMP-7 對(duì)骨組織工程學(xué)以及臨床上治療骨缺損，骨折不愈合，促進(jìn)骨折愈合和脊柱融合提供了依據(jù)。

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