田曉剛，張 璇，馮和璽，白 潔，樸豐源，關(guān) 懷

(1.解放軍第210 醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連116021;2.鐵嶺衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 醫(yī)學(xué)營養(yǎng)系，遼寧 鐵嶺112000;3.大連醫(yī)科大學(xué)勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，遼寧大連116044)

慢性砷中毒損傷高級神經(jīng)系統(tǒng)功能，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，在流行病學(xué)調(diào)查和動物實驗中均得到證實［1］。然而，砷的神經(jīng)毒作用機制至今不清。研究表明，長時程記憶(long -term memory，LTM)是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)［2］;砷對實驗動物學(xué)習(xí)記憶功能的影響與其干擾突觸可塑性、損傷LTM有關(guān)［3］。本研究組前期工作顯示:砷暴露可顯著抑制小鼠腦中誘發(fā)LTM 的重要蛋白激酶Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(Ca2+/calmodulin -dependent protein kinase Ⅳ，CaMKⅣ)基因、蛋白的表達以及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因c -Fos，JunB 的表達，并伴有LTM 形成抑制以及小鼠的運動學(xué)習(xí)能力下降［4］。那么，砷又是如何抑制CaMKⅣ的表達呢?研究表明，CaMKⅣ基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯受一個復(fù)合體調(diào)控，甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor，TR)是這個復(fù)合體的關(guān)鍵成員，而TRα1、TRβ1 和TRβ2 是TR 的3 個功能性受體［5］。因此，本研究假設(shè)砷通過TR/ CaMKⅣ通路介導(dǎo)其神經(jīng)毒作用。

另外，近年的文獻報道，小腦除參加運動功能外，也在運動性學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用［6］。慢性砷中毒小鼠出現(xiàn)小腦神經(jīng)元損傷以及運動性學(xué)習(xí)記憶障礙［4，7］，提示砷導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶下降可能與小腦損傷有關(guān)。本研究組的前期工作也證實砷暴露小鼠小腦組織CaMKⅣ蛋白表達受到抑制，其抑制程度與砷暴露劑量呈明顯正相關(guān)［4］。因此，本研究采用差異表達基因譜芯片篩查亞慢性砷暴露小鼠小腦組織TR 相關(guān)基因的差異表達，Real -time RT -PCR和Western blot 技術(shù)從基因和蛋白水平進行驗證，以期為砷的神經(jīng)毒作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑:染毒試劑三氧化二砷(As2O3)、硝酸(HNO3)、過氧化氫(H2O2)(Sigma，美國);焦碳酸二乙酯(DEPC -Water)(美國Ambion 公司);TR Izol 試劑盒(美國Invitrogen 公司);RNA 純化試劑盒(RNeasy Mini Kit)(德國OIAGEN 公司);RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script TM RT Master Mix)(TaKa-Ra，中國);兔抗小鼠多克隆TRα1 抗體(Abcam，美國)、兔抗小鼠多克隆TRβ1 抗體、小鼠抗小鼠單克隆TRβ2 和β-actin(SANTA CRUS，美國)。

1.1.2 主要儀器:WX -Ⅱ型小鼠跳臺自動控制儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，中國);全自動芯片洗滌工作站450、基因芯片雜交箱640(Affymetrix 公司，美國);HC-2518R 高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，中國);Real -time PCR檢測儀(Thermo Cycler Dice Real Time System TP800)(TAKARA 公司，日本);DYCZ -240 型垂直板電泳槽(北京六一儀器廠，中國);DYY -12 型電腦三恒多用電泳儀(北京六一儀器廠，中國);酶標(biāo)儀(Thermo Electron Corporation，美國);UVP 凝膠成像系統(tǒng)(UVP 公司，美國)。

1.2 方 法

1.2.1 動物分組及處理:SPF 級昆明種小鼠40 只，雌雄各半，體重(20 ±2)g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。按體重將小鼠隨機分為4 組，每組10只，雌雄各半，根據(jù)其飲水As2O3濃度，分別為0 mg/L(對照組)、1 mg/L、2 mg/L 和4 mg/L(染砷組)。普通飼料，自由采食。飼養(yǎng)室溫度(22 ±3)℃，濕度40%左右。連續(xù)染毒60 d，先行為學(xué)實驗，后脫頸法處死小鼠，取小腦組織，-80 ℃凍存。

1.2.2 行為學(xué)實驗—跳臺實驗:先將小鼠放于電跳臺箱內(nèi)適應(yīng)5 min，以消除探究反應(yīng)。底部銅柵通電(36 V)，小鼠在受電刺激中逐漸學(xué)會跳上平臺回避電擊。多數(shù)動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又重新跳回平臺，訓(xùn)練5 min，24 h 后將小鼠置于平臺上，銅柵通電。觀察小鼠第1 次跳下安全臺的潛伏期、5 min 內(nèi)小鼠跳下平臺的錯誤次數(shù)。若小鼠停留在平臺上超過5 min，其潛伏期以300 s記錄。

1.2.3 差異表達基因譜芯片制作及數(shù)據(jù)分析:從對照組、2 mg/L 和4 mg/L 染砷組隨機選取小腦樣本。TRIzol 法提取總RNA，純化，分光光度計定量，質(zhì)檢，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;體外轉(zhuǎn)錄合成cRNA 探針，生物素標(biāo)記;生物素標(biāo)記的cRNA 探針經(jīng)片段化處理后與Mouse Genome 430 2.0 Araay 基因芯片在雜交箱640 中45 ℃雜交16 h，然后于全自動芯片洗滌工作站450 中洗脫、染色;最后用GeneArrayT M 掃描儀3000 掃描雜交信號。雜交結(jié)果采用Microarray Suite Version 5.0 分析軟件(Affymetrix 公司，美國)進行分析。

1.2.4 Real -time RT -PCR 測定TRα 和TRβ 的mRNA 表達:引物設(shè)計見表1。TRIzol 法提取小腦組織總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體積20 μL，42 ℃45 min 后反轉(zhuǎn)錄，85 ℃10 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20 ℃保存或立即進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)條件設(shè)定為預(yù)變性95 ℃3 min，95 ℃12 s，62 ℃40 s，40 個循環(huán)。

表1 TR 基因引物Tab 1 Specific primer sequences for TR genes

1.2.5 Western blot 測定TRα1、TRβ1 和TRβ2 的蛋白表達:預(yù)冷組織蛋白抽提試劑，加入Roche 蛋白酶抑制劑及PMSF，配制成裂解液。向各暴露組腦組織中加入裂解液，用眼科剪剪碎后在冰水混合物中用Fluko 電動勻漿器15 000 r/min 勻漿30 s，在冰上孵育20 min，4 ℃13 000 r/min 離心20 min，取上清BCA 法進行蛋白定量。取35 μg 蛋白進行SDSPAGE 電泳，90 V 電泳2 h，電泳結(jié)束后濕式轉(zhuǎn)至PVDF 膜35 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，抗體結(jié)合:TRα1(1∶500)/IgG(1∶5 000)、TRβ1 (1∶50)/IgG(1∶2 000)、TRβ2(1∶50)/IgG(1∶5 000)、β - actin(1∶400)/IgG(1∶2 500)。ECL 顯色發(fā)光，UVP 掃描分析，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 亞慢性砷暴露對小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力影響

跳臺實驗中，隨染砷劑量增加，各組小鼠發(fā)生錯誤次數(shù)逐漸增加，錯誤潛伏期逐漸縮短，均呈劑量-反應(yīng)關(guān)系(P ＜0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠跳臺實驗結(jié)果比較Tab 2 Results of step-down test

2.2 亞慢性砷暴露小鼠小腦組織TR 相關(guān)基因譜的差異表達

與對照組比較，2 mg/L 和4 mg/L 染砷組小鼠小腦組織TRβ 的基因表達顯著下調(diào)(P ＜0.05)，隨染砷劑量增加下調(diào)程度加重;染砷組小鼠小腦組織TRα 的基因表達無顯著變化(P ＞0.05)。詳見圖1。

2.3 亞慢性砷暴露對小鼠小腦組織TRα 和TRβ mRNA 表達的影響

Real-time RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，各染砷組小鼠小腦組織TRα 的mRNA 表達均無顯著變化(P ＞0.05);染砷組小鼠小腦組織TRβ的mRNA 表達隨染砷劑量增加逐漸降低，組間兩兩比較，差異均有顯著性意義(P ＜0.05)，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。詳見圖2。

圖1 砷暴露小鼠小腦組織TRα 和TRβ mRNA 水平的差異表達Fig 1 The differential mRNA transcription levels of TRα andTRβ in cerebellum of As exposed mice

圖2 各組小鼠小腦組織TRα 和TRβ mRNA 表達結(jié)果Fig 2 The expression of TRα and TRβ mRNA in cerebellum of mice

2.4 亞慢性砷暴露對小鼠小腦組織TRα 和TRβ蛋白表達的影響

Western-blot 檢測結(jié)果顯示，染砷組小鼠小腦組織TRβ1 的蛋白表達低于對照組，2 mg/L 和4 mg/L 染砷組與對照組比較，差異有顯著性意義(P ＜0.05)，并且，4 mg/L 染砷組小鼠小腦組織TRβ1 的蛋白表達也顯著低于2 mg/L 染砷組(P ＜0.05);TRα 和TRβ2 的蛋白表達在各組小鼠間比較，差異均無顯著性意義(P ＞0.05)。詳見圖3。

圖3 各組小鼠小腦組織TRα 和TRβ 蛋白表達結(jié)果Fig 3 The expression of TRα and TRβ protein in cerebellum of mice

3 討 論

長時程增強(LTP)和長時程抑制(LTD)是突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式，兩者相互影響，調(diào)控LTM的形成，是學(xué)習(xí)記憶活動的生物學(xué)基礎(chǔ)［2］。LTP 強化記憶的形成，LTD 對記憶的內(nèi)容進行選擇、確信、核實、提高相鄰?fù)挥|LTP 誘導(dǎo)的敏感性，進而提高神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建的精細度和靈活性。若改變LTP 或LTD，則破壞了學(xué)習(xí)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，進而破壞LTM 的形成。一些文獻報道，砷暴露能導(dǎo)致實驗動物或斑馬魚的學(xué)習(xí)、記憶功能降低，其機制可能與砷抑制LTP 的誘導(dǎo)過程及損傷LTM 有關(guān)［3］。另有研究表明，酒精、皮質(zhì)酮等對學(xué)習(xí)、記憶等認知功能的影響可能與其干擾突觸可塑性的另一種形式LTD 的誘導(dǎo)有關(guān)［8-9］。提示，包括LTP 和LTD 在內(nèi)的LTM 通路可能是許多神經(jīng)毒物損傷性影響學(xué)習(xí)記憶功能的重要靶部位。探討神經(jīng)毒物對LTM 通路干擾的毒作用機制成為當(dāng)前國內(nèi)外神經(jīng)毒理學(xué)家們研究的熱點。

LTM 的形成和維持依賴于神經(jīng)元之間突觸效能的改變，需要基因轉(zhuǎn)錄及新的記憶蛋白合成。當(dāng)各種刺激信息進入海馬等處神經(jīng)元，促使突觸前膜釋放遞質(zhì)谷氨酸，后者作用于突觸后膜N -甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)，使NMDAR 激活，離子通道開啟，大量Ca2+內(nèi)流，使胞內(nèi)Ca2+濃度升高。當(dāng)Ca2+與鈣調(diào)蛋白(CaM)結(jié)合時，活化鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶激酶(Calmodulin dependent protein kinase kinases，CaMKK)，CaMKK 進一步磷酸化活化激活CaMKⅣ/cAMP 反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)等信號途徑的一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致下游學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達［4］。本研究組前期工作顯示:砷暴露小鼠小腦組織CaMKⅣ蛋白表達受到抑制，并伴有LTM 形成抑制以及小鼠的運動學(xué)習(xí)能力降低［4］。提示，CaMKⅣ是砷抑制LTM 誘導(dǎo)的關(guān)鍵靶點。

CaMKⅣ基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是由三碘甲腺原氨酸(T3)與甲狀腺激素受體(TR)-視黃醇類X 受體(RXR)異二聚體(TR-RXR)結(jié)合而特異性介導(dǎo)的，此復(fù)合體的作用位點為CaMKⅣ基因上游啟動子的TH 反應(yīng)原件(TRE)。TRα1、TRβ1 和TRβ2 等三種功能性受體與T3的結(jié)合能夠解除CaMKⅣ基因啟動子TRE 的抑制狀態(tài)，從而介導(dǎo)CaMKⅣ基因的表達。文獻報道，砷能夠明顯抑制功能性TR 及其介導(dǎo)的基因的表達［10］。本研究中，基因芯片篩選出砷暴露小鼠小腦組織TRβ 基因與對照組表達差異明顯;經(jīng)Real-time RT-PCR 發(fā)現(xiàn)，砷暴露對TRβ mRNA 表達有明顯抑制作用，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系;經(jīng)Western blot 發(fā)現(xiàn)，砷暴露TR 功能性受體TRα1 和TRβ2的基因、蛋白表達沒有顯著影響，但對TRβ1 的蛋白表達有抑制作用，尤其在中、高劑量染砷組。本組研究結(jié)果表明，砷暴露可能通過抑制TRβ1 的基因、蛋白表達導(dǎo)致異二聚體TR - RXR 減少，其后T3與TR-RXR 結(jié)合形成復(fù)合體減少，進而，該復(fù)合體在CaMKⅣ基因上游與T3結(jié)合從而解除啟動子抑制狀態(tài)的作用被削弱，最終，CaMKⅣ基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平受到抑制，LTM 過程受損。

本研究證實，砷暴露小鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降，其機制可能與抑制TR 的功能性受體TRβ1 表達，進而損傷LTM 有關(guān)。

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