呂莎莎，劉寬芝

辛伐他汀降低2型糖尿病大鼠心肌Toll樣受體4表達

呂莎莎，劉寬芝

目的：觀察辛伐他汀對2型糖尿病大鼠心肌 Toll樣受體4（TLR4）表達的影響。

Toll樣受體4；辛伐他??；糖尿病心肌病變；炎癥反應

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:64.)

糖尿病性心臟病嚴重威脅糖尿病患者的生命，約占糖尿病患者死因的70%～80%[1]。目前，天然免疫系統(tǒng)的激活和慢性低度炎癥為糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機理提供了新依據(jù)，Toll樣受體4（TLR4）是免疫反應和介導炎癥的重要模式識別受體，也是聯(lián)系二者的樞紐，因此可將TLR4作為炎癥和自身免疫性疾病的治療靶點。辛伐他汀的抗炎作用對降低2型糖尿病患者的心血管病風險具有重要意義。本文探討辛伐他汀對糖尿病大鼠心肌TLR4表達的影響。

1 材料與方法

主要材料：40只雄性清潔級SD大鼠，鼠齡6周，體重為（180±20）g，購自河北醫(yī)科大學動物實驗中心。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司生產(chǎn)），辛伐他汀[默沙東制藥有限公司產(chǎn)品（批號：X920345）]，兔抗大鼠TLR4蛋白抗體（武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)），兔二步法免疫組化試劑盒（北京中杉生物科技有限公司，PV-6001），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大立陶宛Fermentas公司），脫氧核糖核酸（DNA）引物（北京賽百盛生物有限公司）。

動物模型制備及分組：于2012-03至2013-11將40只雄性SD大鼠隨機分為對照組（n=10）和實驗組（n=30）。其中對照組予以普通飼料，實驗組用高糖高脂飼料（普通飼料中加入20%白砂糖、2.5%膽固醇、15%熟豬油）喂養(yǎng)。4周后，實驗組腹腔內(nèi)一次性注射鏈脲佐菌素（30 mg/kg），對照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。實驗組30只大鼠6周后測定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)降低者作為2型糖尿病大鼠模型[2]，共26只，將其隨機分為糖尿病組（n=13）和辛伐他汀組（n=13）。辛伐他汀組給予20 mg/（kg.d）辛伐他汀灌胃，對照組和糖尿病組均予等體積生理鹽水灌胃[3]，共8周。

標本采集及生化指標檢測：實驗結(jié)束時，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉大鼠，心臟取血，離心，留取血清標本，-20℃保存，待用于生化指標的測定。迅速取部分心臟組織以4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，待蘇木素伊紅（HE）染色和免疫組織化學染色。空腹血糖以Roch血糖儀測定；肌酸激酶及血脂采用全自動生化分析儀（日本olympus公司生產(chǎn)）檢測；空腹胰島素水平用雙抗體放射免疫分析法檢測；胰島素敏感指數(shù)=1/（空腹血糖×空腹胰島素水平）。

光鏡觀察：切片常規(guī)脫蠟至水，HE染色3 min，自來水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水洗1 min，HE染色2 min，自來水洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯胺透明，中性樹脂封片，光鏡觀察。

免疫組織化學法檢測TLR4表達：心臟組織標本用4%甲醛固定后脫水、浸蠟包埋、切片，按照免疫組化試劑盒說明進行操作。一抗為1:200稀釋的TLR4蛋白抗體。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑顯色后充分沖洗，HE復染，脫水，透明，封片。光鏡下每張切片選取5個視野，應用Image-Pro Plus 6.0病理圖像分析軟件計算TLR4陽性表達的光密度平均值[累積光密度（IOD）/面積（Area）]。

逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應法（RT-PCR）檢測TLR4表達：提取總的核糖核酸（RNA）后逆轉(zhuǎn)錄合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），再用cDNA進行多聚酶連反應。反應條件: 94℃預變性3 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，72℃延伸5 min，共40個循環(huán)。TLR4引物：上游引物： 5'-TCAGTGTGCTTGTGGTAG-3'，下游 引 物： 5'-TCTGCTAAGAAGGCGATAC-3'， 片段長度458 bp；β-actin引物的序列：上游引物5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游引物：5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，片段長度150 bp。擴增產(chǎn)物行1% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察、拍照及分析，且應用Image J凝膠圖像分析處理系統(tǒng)計算目的片斷TLR4/β-actin條帶的OD比值。

統(tǒng)計學處理：應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件處理實驗數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗，服從正態(tài)分布資料以均數(shù)±標準差表示，偏態(tài)分布以中位數(shù)、四分位數(shù)間距表示。多組比較采用單因素方差分析，組間比較應用SNK檢驗。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

生化指標變化：糖尿病組和辛伐他汀組的空腹血糖均明顯高于對照組（P＜0.05）；而前兩組間的空腹血糖無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。糖尿病組、辛伐他汀組的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平均明顯高于對照組，辛伐他汀組的甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平低于糖尿病組（P＜0.05）。三組大鼠的高密度脂蛋白膽固醇、肌酸激酶比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。表1

表1 大鼠生化指標的變化（）

表1 大鼠生化指標的變化（）

注：與對照組比較*P＜0.05，與糖尿病組比較△P＜0.05。肌酸激酶采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示

組別 例 空腹血糖(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)總膽固醇(mmol/L)低密度脂蛋白膽固醇(mmol/L)高密度脂蛋白膽固醇(mmol/L) 肌酸激酶 (U/L)對照組 10 5.92±1.28 0.80±0.21 2.47±0.59 1.21±0.29 1.87±0.33 952 (623)糖尿病組 13 12.04±2.04* 1.86±0.22* 5.15±1.09* 2.13±0.17* 0.67±0.17* 1307(1430)辛伐他汀組 13 11.23±2.61* 1.13±0.27*△ 3.30±0.91*△ 1.67±0.33*△ 1.27±0.30 1375(741)

心肌形態(tài)學改變：對照組大鼠心肌細胞排列規(guī)則，細胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核似橢圓形或長方形，胞質(zhì)清晰，偶見炎細胞。糖尿病組心肌細胞結(jié)構(gòu)不清，細胞明顯水腫,可見廣泛心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，大量炎細胞浸潤。辛伐他汀組的心肌改變較糖尿病組明顯減輕。圖1

圖1 三組大鼠心肌HE染色（×100）

心肌Toll受體4蛋白表達水平：心肌TLR4蛋白表達主要表現(xiàn)為心肌細胞胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒沉著。對照組大鼠心肌有少量表達，呈淺棕黃色；糖尿病組TLR4的蛋白表達明顯高于對照組，呈棕黃色；辛伐他汀組TLR4的表達較糖尿病組明顯減少，但仍多于對照組（圖2）。糖尿病組的IOD/Area （0.6157±0.0233）是對照組（0.3210±0.0151）的192%（P＜0.05）；辛伐他汀組IOD/Area（0.4302±0.0224）是糖尿病組的69.87%（P＜0.05），兩者差異均有統(tǒng)計學意義。

逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應法分析心肌TLR4 mRNA表達水平：心肌TLR4 mRNA的表達結(jié)果以rTLR4表示（rTLR4＝TLR4 OD值/β-actin OD值）。糖尿病組大鼠心臟rTLR4（1.43±0.16）是對照組（0.42±0.06）的341%（P＜0.05）；辛伐他汀組（0.73±0.13）是糖尿病組的51.05% （P＜0.05），兩者差異均有統(tǒng)計學意義。圖3。

圖2 免疫組織化學染色法檢測大鼠心肌 Toll樣受體4蛋白表達（×200）

圖3 各組大鼠心臟心肌 Toll樣受體4 信使核糖核酸的表達

3 討論

本實驗復制2型糖尿病大鼠模型，HE染色示心肌細胞結(jié)構(gòu)不清，細胞水腫、變性，廣泛性心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，大量炎細胞浸潤等，說明糖尿病大鼠已經(jīng)出現(xiàn)心肌病變，但肌酸激酶水平與對照組比較無統(tǒng)計學差異，推測此時處于病變的早期，因此尚需延長實驗時間以進一步觀察。研究發(fā)現(xiàn)靜脈內(nèi)皮細胞中活化TLR4通過TLR/核因子-κ B（NF-κ B）信號傳導通路介導非耐受性炎癥反應[4]。Reyna等[5]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者肌肉組織中TLR4 mRNA表達和蛋白質(zhì)含量明顯升高，且其抑制蛋白-κB（IKB）／NF-κ B信號通路激活程度也增加。但國內(nèi)外對于TLR4與糖尿病性心肌病變之間關系的研究尚不多見，吳鏗等[6]發(fā)現(xiàn)TLR4與腫瘤壞死因子-α在糖尿病心肌灌注的炎性損傷中具有重要作用。本實驗糖尿病大鼠HE染色顯示心肌發(fā)生了炎癥和損傷，免疫組織化學染色和RT-PCR結(jié)果顯示與正常對照組比較，糖尿病組TLR4的蛋白和mRNA表達水平明顯升高，這說明TLR4可能參與了糖尿病心肌病變的發(fā)生、發(fā)展。

在糖尿病狀態(tài)下，TLR4的表達水平明顯升高，可能與下列因素有關：高血糖能激活蛋白激酶C和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，從而誘導TLR4表達，進而通過一系列反應引起NF-κ B易位進入細胞核內(nèi)，致炎癥反應的發(fā)生，使心肌受損、細胞凋亡、血管內(nèi)皮重構(gòu)、心室肥厚及心臟功能障礙等[7]；2型糖尿病患者存在體重增加、胰島素抵抗、氧化應激增強等，這些可使TLR4內(nèi)源性配體熱休克蛋白60、游離脂肪酸、內(nèi)毒素等增多，從而激活TLR4-NF-κ B信號通路，致TLR4表達增加、細胞因子及炎性介質(zhì)釋放，引發(fā)炎癥反應。TLR4的表達水平升高，又可促進糖尿病心肌病變的發(fā)生發(fā)展[8]。TLR4與各種內(nèi)外源性配體結(jié)合后，可通過一系列蛋白質(zhì)級聯(lián)反應激活NF-κ B抑制蛋白激酶（IKK），激活的IKK一方面通過絲氨酸磷酸化增加，減弱胰島素信號通路，最終產(chǎn)生胰島素抵抗；另一方面通過降解NF-κ B抑制因子a，從而調(diào)控炎性反應因子的表達，從而間接導致胰島素抵抗[9]。通過上述兩種途徑導致胰島素抵抗，進而加速心肌病變的發(fā)生發(fā)展?？傊赥LR4的參與下，各機制之間相互作用，共同參與糖尿病心肌病變的發(fā)生發(fā)展。

有研究表明，他汀類藥物能降低健康人及高膽固醇血癥患者外周血單核細胞表面TLR4表達及其下游的信號分子[10-12]。Satoh等[13]發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過MicroRNA let-7i的表達下調(diào)冠狀動脈疾病患者的TLR4信號，從而發(fā)揮抗炎作用。本實驗中辛伐他汀組與糖尿病組相比，TLR4的蛋白和mRNA表達水平明顯降低，且心肌細胞水腫、變性，心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，炎細胞浸潤等情況亦明顯減輕，說明辛伐他汀可能通過下調(diào)心臟TLR4 的表達而抑制TLR4信號轉(zhuǎn)導通路，阻斷細胞因子及炎性介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮對心肌病變的保護作用。但由于干預時間短且無陽性對照，因此尚需更多的動物實驗和臨床研究去進一步證實。

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Simvastatin Reducing the Expression of Myocardial Toll Like Receptor 4 in Type 2 Diabetic Rats

LV Sha-sha, LIU Kuan-zhi.

Department of Endocrinology, the Third Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050051), Hebei, China

LIU Kuan-zhi, Email: Liu-kuanzhi@163.com

Objective: To observe the effect of simvastatin on reducing the expression of myocardial Toll like receptor 4 (TLR4) in type 2 diabetic rats.Methods: A total of 40 male SD rats were divided into 2 groups, Control group, n=10, the rats had normal feed and Experimental group, n=30, the rats received hyperglycemia and hypelipaemia feed for 6 weeks. There were 26 experimental rats with fasting blood glucose ＞7.8 mmol/L def i ned as diabetic rats and divided into 2 groups, Diabetic group, the rats received the normal saline, and Simvastatin group, the rats received simvastatin 20mg/(kg.d) for 8 weeks. n=13 in each group. The myocardial tissue was examined by optical microscopy, TLR4 protein and mRNA expressions were measured by immuno histochemistry and RT-PCR respectively in different groups.Results: Compared with Control group, the myocardial tissue in Diabetic group showed obvious edema and inf l ammatory cell inf i ltration, those damages were much less in Simvastatin group. The immuno-histochemistry and RTPCR presented that TLR4 protein and mRNA expressions in Diabetic group (0.6157 ± 0.0233) and (1.43 ± 0.16) were signif i cantly higher than those in Control group (0.3210 ± 0.0151) and (0.42 ± 0.06) all P<0.05. The TLR4 protein and mRNA expressions in Simvastatin group (0.4302 ± 0.0224) and (0.73 ± 0.13) were lower than Diabetic group but higher than Control group, all P<0.05.Conclusion: Simvastatin may reduce the expressions of TLR4 protein and mRNA and decrease the inflammatory reaction therefore protect the cardiac tissue in experimental rats.

Toll like receptor 4; Simvastatin; Diabetic cardiopathy; Inf l ammatory reaction

2013-09-03）

（助理編輯：許菁）

050051 河北省石家莊市,河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院 內(nèi)分泌1科

呂莎莎 碩士研究生 主要從事糖尿病與代謝性疾病的研究 Email: 413969935@qq.com 通訊作者：劉寬芝Email: Liu-kuanzhi@163.com

R54

A

1000-3614（2014）01-0064-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.017

方法：40只雄性SD大鼠隨機分為對照組（n=10）和實驗組（n=30）。其中對照組給予普通飼料，實驗組用高糖高脂飼料喂養(yǎng)。6周后測定空腹血糖＞7.8 mmol/L且伴有胰島素敏感指數(shù)降低的大鼠作為2型糖尿病大鼠模型，共26只，將其隨機分為糖尿病組（n=13）和辛伐他汀組（n=13）。干預治療8周。留取心臟組織做光鏡觀察，分別采用免疫組織化學染色和逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應法（RT-PCR）檢測各組大鼠心肌TLR4蛋白和信使核糖核酸（mRNA）的表達。

結(jié)果：與對照組比較，光鏡下可見糖尿病組心肌細胞明顯水腫，并可見大量炎細胞浸潤，辛伐他汀組心肌組織損傷較糖尿病組明顯減輕。免疫組織化學染色和RT-PCR顯示，糖尿病組大鼠TLR4蛋白和mRNA表達分別為0.6157±0.0233和1.43±0.16，明顯高于對照組（0.3210±0.0151和0.42±0.06，P＜0.05）；辛伐他汀組大鼠TLR4 蛋白和mRNA表達分別是0.4302±0.0224和0.73±0.13，低于糖尿病組（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

結(jié)論:辛伐他汀從蛋白和mRNA水平下調(diào)2型糖尿病大鼠心肌TLR4的表達、降低炎癥反應，進而發(fā)揮對心臟的保護作用。