高妮妮，王芳，廉哲勛

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路在三磷酸腺苷后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用

高妮妮，王芳，廉哲勛

目的：探討磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信號(hào)通路在三磷酸腺苷（ATP）后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用。

三磷酸腺苷；心肌缺血再灌注損傷；磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:59.)

心肌梗死是冠心病死亡的主要原因。隨著溶栓、急診介入治療、冠狀動(dòng)脈（冠脈）旁路移植術(shù)等血管再灌注療法的應(yīng)用，及時(shí)恢復(fù)缺血組織的供血可有效挽救瀕死心肌[1]。但是，在成功恢復(fù)心臟血流的同時(shí)，隨之而來的缺血再灌注損傷（IRI）會(huì)導(dǎo)致心肌代謝功能障礙，并且進(jìn)一步加重結(jié)構(gòu)破壞，造成二次損傷，甚至出現(xiàn)心律失常、梗死面積擴(kuò)大。因此尋求再灌注時(shí)保護(hù)心肌的新靶點(diǎn)及藥物至關(guān)重要。近年來，隨著缺血再灌注損傷分子機(jī)制的研究不斷深入，再灌注損傷挽救激酶在缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用已逐漸明確。有研究表明，挽救激酶通路中的磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）信號(hào)通路介導(dǎo)了缺血后處理減輕心肌缺血再灌注損傷的作用[2]。我們前期實(shí)驗(yàn)表明，三磷酸腺苷（ATP）后處理可通過PI3KAkt信號(hào)通路減輕兔心肌缺血再灌注損傷[3]，但其具體機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制兔急性心肌缺血再灌注損傷模型，于再灌注初期給予ATP及再灌注前分別給予PI3K阻斷劑、線粒體ATP依賴性鉀通道（mitoKATP）阻斷劑，探討PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路在ATP后處理減輕兔心肌缺血再灌注損傷中的作用，并推測其下游分子機(jī)制。

1　材料與方法

實(shí)驗(yàn)材料:本研究起始于2013-02至2013-04。健康新西蘭大白兔48只，體重2.0～2.5 kg，由山東農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供[許可證號(hào)：SCXK（魯）20100005]。磷酯酰肌醇-3激酶抑制劑（Wortmannin）、線粒體ATP依賴性鉀通道抑制劑5-羥葵酸（5-HD）購于美國Sigma公司；ATP二鈉注射液購于天津藥業(yè)焦作有限公司，批號(hào)11101241；兔抗p-eNOS（ser1177），Bcl-2抗體，Bax抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Tunel試劑盒購于德國Roche公司；蘇木素伊紅（HE）染液購于石家莊德薩商貿(mào)。

兔心肌缺血再灌注模型的建立及成功的標(biāo)準(zhǔn)：新西蘭大白兔稱重，25 %烏拉坦（5 mg/kg）腹腔注射，麻醉后仰臥位固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，連接生理記錄儀，全程記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖。沿胸骨左緣剪斷第3、4肋骨，無氣胸開胸，暴露心臟，提起心包并剪開，在左心耳下確定冠脈左前降支位置，于左心室中上1/3水平用雙股4-0號(hào)絲線鉤繞該血管，以單股線結(jié)扎造成缺血（另一股線再灌注后用），結(jié)扎時(shí)用細(xì)小硬質(zhì)膠管墊于血管與結(jié)扎線之間，結(jié)扎成功后，關(guān)閉胸腔，待40 min后重新打開，剪開結(jié)扎線，再灌注心肌180 min。 模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)：① 結(jié)扎后心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST-T段明顯抬高，再灌注后抬高的ST-T段下降1/2以上；② 結(jié)扎后左心室前壁由紅色明顯變暗，再灌注成功時(shí)恢復(fù)為紅色。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、再灌注方案：將48只健康新西蘭大白兔隨機(jī)分為4組，每組12只。① 缺血再灌注組（對照組）: 結(jié)扎冠脈左前降支40 min，再灌注l80 min；②ATP后處理組: 結(jié)扎冠脈左前降支40 min，于再灌注開始時(shí)自耳緣靜脈給予ATP（3 mg/kg），共持續(xù)30 min，持續(xù)再灌注180 min；③Wortmannin+ATP 后處理組（Wortmannin+ATP組）：結(jié)扎冠脈左前降支40 min，再灌注開始前5 min靜脈注射Wortmannin（0.6 mg/kg），再灌注開始時(shí)靜脈給予ATP（3 mg/kg），共持續(xù)30 min，持續(xù)再灌注180 min；④ 5-HD+ATP后處理組（5-HD+ATP組）：結(jié)扎冠脈左前降支40 min，再灌注開始前5 min靜脈注射5-HD（5 mg/kg），再灌注開始時(shí)靜脈給予ATP（3 mg/kg），共持續(xù)30 min，持續(xù)再灌注180 min。 每組12只實(shí)驗(yàn)兔中6只用于HE染色觀察心肌病理組織變化，6只用于留取心肌組織進(jìn)行細(xì)胞凋亡因子的檢測和磷酸化蛋白（p-eNOS）的測定。

檢測指標(biāo)：灌注結(jié)束后，取適量缺血區(qū)左心室前壁全層心肌組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，連續(xù)切片數(shù)張，供HE染色、TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bcl-2、Bax和p-eNOS測定。

形態(tài)學(xué)觀察：將上述石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞的病理改變。

TUNEL法心肌細(xì)胞凋亡的表達(dá)：采用TUNEL試劑盒檢測各組標(biāo)本心肌細(xì)胞的凋亡。按照試劑盒說明書操作。標(biāo)記前用脫氧核糖核酸（DNA）酶處理切片做陽性對照，用標(biāo)記液代替TdT酶反應(yīng)液做陰性對照。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野 ，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)和所有細(xì)胞個(gè)數(shù)，以凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)/所有細(xì)胞個(gè)數(shù)的百分比作為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，反映各組心肌細(xì)胞凋亡的情況。

免疫組織化學(xué)檢測心肌凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和p-eNOS蛋白的表達(dá)：應(yīng)用與上述TUNEL法相同的組織蠟塊切片行Bcl-2、Bax和p-eNOS蛋白免疫組織化學(xué)檢測。一抗：1：200 PBS緩沖液稀釋的Bcl-2、Bax抗體和p-eNOS抗體。具體步驟按SP試劑盒說明書操作，辣根過氧化物酶（DAB）顯色，中性樹脂封片。陽性表達(dá)細(xì)胞被染成棕黃色，Bax蛋白主要存在于胞漿內(nèi)，部分在胞核，Bcl-2蛋白為核膜和胞漿表達(dá)，p-eNOS陽性細(xì)胞胞漿呈棕褐色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量和著色強(qiáng)度，取平均值，并采用公式：免疫組化評(píng)分（IHS）=A×B進(jìn)行數(shù)據(jù)換算，A為陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：0～1%=0，1～10%=1，10～50%=2，50～80%=3，80～100%=4；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)：0=陰性，1=弱陽性，2=陽性，3=強(qiáng)陽性。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，各項(xiàng)觀察指標(biāo)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

各組光鏡心肌組織學(xué)的改變：對照組（圖1a）、Wortmannin+ATP組（圖1c）、5-HD+ATP組（圖1d）心肌細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間質(zhì)腫脹嚴(yán)重，細(xì)胞界限不清，橫紋消失。ATP后處理組（圖1b）心肌細(xì)胞核濃縮、變小減輕，心肌細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)輕度水腫，細(xì)胞界限相對清楚，心肌細(xì)胞排列相對規(guī)則。圖1

圖1　各組光鏡心肌組組織學(xué)改變（箭頭所指為心肌間質(zhì)水腫）

各組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 ：對照組（圖2a）、Wortmannin+ ATP組（圖2c）、5-HD+ATP組（圖2d），均可見較多TUNEL陽性凋亡細(xì)胞；ATP后處理組（圖2b）心肌凋亡細(xì)胞明顯減少。（圖2）。ATP后處理組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（12.17±3.49）%低于對照組（24.00±4.00）%、Wortmannin+ ATP組（24.33±5.16）%和 5-HD+ATP組（25.33 ±4.97）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對照組、Wortmannin+ ATP組、5-HD+ATP組三組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2　TUME法檢測各組凋亡心肌細(xì)胞（箭頭所指為凋亡細(xì)胞）

各組心肌組織凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax表達(dá)及Bcl-2/Bax比值的比較：免疫組化分析顯示，ATP后處理組與對照組、Wortmannin+ATP組和5-HD+ATP組相比，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值升高，促凋亡因子Bax表達(dá)減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對照組、Wortmannin+ ATP組、5-HD+ATP組3個(gè)組間比較，各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表1

表1　免疫組化分析各組心肌組織凋亡相關(guān)因子及Bcl-2/Bax比值

表1　免疫組化分析各組心肌組織凋亡相關(guān)因子及Bcl-2/Bax比值

注：與對照組比較*P＜0.01　與 Wortmannin+ATP組比較△P＜0.01　與5-HD+ATP組比較▲P＜0.01。　余注見圖1

組別　　　　　　　Bcl-2（%）　Bax（%）　Bcl-2/Bax對照組　　　　　　　4.00±1.26　6.50±2.26　0.63±0.09 ATP后處理組　　　　7.33±2.42*△▲　3.67±1.51*△▲　2.08±0.56*△▲Wortmannin+ATP組　　　　4.00±1.79　7.00±1.55　0.57±0.18 5-HD+ATP組　　　　　4.33±1.51　7.00±2.45　0.63±0.09

各組心肌組織p-eNOS蛋白的表達(dá)：免疫組化分析顯示，心肌組織p-eNOS蛋白的陽性表達(dá)ATP后處理組 [（8.33±0.52）%]（圖3b）和5-HD+ATP組[（8.67±1.63）%] （圖3d） 較對照組[（4.67±1.03）%] （圖3a）和Wortmannin+ATP組[（4.17±0.98）%] （圖3c）升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Wortmannin+ATP組與對照組、ATP后處理組與5-HD+ATP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。圖3

圖3　免疫組化顯示各組心肌細(xì)胞磷酸化蛋白表達(dá)( 箭頭所指為陽性細(xì)胞）

3　討論

再灌注損傷挽救激酶通路是目前研究較多的信號(hào)通路，包括磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2），在缺血再灌注時(shí)發(fā)心肌保護(hù)作用。其心肌保護(hù)機(jī)制包括三方面：阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放；促進(jìn)肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝??；恢復(fù)抗細(xì)胞凋亡途徑[4]。細(xì)胞凋亡減少可保護(hù)缺血再灌注損傷心肌[5]。PI3KAkt-eNOS信號(hào)通路已被證明是再灌注損傷挽救激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路的組成之一[6]?；罨腁kt主要通過磷酸化eNOS促進(jìn)內(nèi)源性NO生成，激活核糖體蛋白S6激酶（p70S6K），磷酸化糖原合成激酶-3β（GSK-3β）等，最終增加鉀離子通道開放進(jìn)而保護(hù)缺血再灌注損傷心肌[7]。研究表明，大鼠eNOS基因的過度表達(dá)可在心肌缺血再灌注后起心臟保護(hù)作用[8，9]，敲除eNOS基因的小鼠異氟烷再灌注損傷保護(hù)作用消失[10]。本實(shí)驗(yàn)在心肌再灌注即刻給予ATP后處理，eNOS磷酸化水平明顯增加同時(shí)缺血再灌注損傷減輕，證明eNOS在缺血再灌注損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

1992年Gross等[11]首先提出ATP敏感性鉀通道（ KATP）與缺血預(yù)處理（IP）有關(guān)，依據(jù)是格列本脲（glibenclamide，非選擇性KATP通道阻斷劑）可以阻斷IP的心臟保護(hù)作用。已知心肌細(xì)胞中存在兩種KATP通道，即線粒體KATP通道和心肌細(xì)胞膜KATP通道（sarcKATP）。Mykytenko等[12]通過分別給予線粒體及胞膜KATP阻斷劑發(fā)現(xiàn)，線粒體KATP通道而并非sarcKATP開放在缺血后處理的心肌保護(hù)作用中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)中給予線粒體KATP通道阻斷劑5-HD后，ATP的心肌保護(hù)作用同時(shí)被阻斷。后處理的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中eNOS與線粒體KATP通道間的相關(guān)性尚未明確。但細(xì)胞水平的研究發(fā)現(xiàn)NO可激活線粒體KATP通道，推測線粒體KATP通道可能是eNOS 的下游途徑，eNOS 通過直接增加線粒體KATP通道的開放而最終導(dǎo)致心臟保護(hù)作用[13]。

我們前期試驗(yàn)證實(shí)ATP可激活再灌注損傷挽救激酶通路，使Akt磷酸化增多，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[2]。本實(shí)驗(yàn)中ATP后處理顯著減輕缺血再灌注心肌水腫，減少心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)eNOS磷酸化表達(dá)增加，此作用可被PI3K阻斷劑wortmannin阻斷，提示ATP后處理可能通過激活PI3K-Akt信號(hào)通路，誘導(dǎo)增加磷酸化eNOS 蛋白表達(dá)而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。此外，應(yīng)用線粒體KATP通道阻斷劑5-HD并未影響ATP磷酸化eNOS的作用，但消除了其心肌保護(hù)作用，從側(cè)面反應(yīng)了線粒體KATP通道可能是eNOS的下游途徑。已知ATP在體內(nèi)迅速代謝為腺苷，Yang等[14]研究證實(shí)腺苷可通過激活PI3K、ERK1/2及NOS縮小心肌梗死面積。因此本研究推測，ATP后處理可能通過代謝為腺苷，激活挽救激酶通路中的PI3K-Akt，而后使下游分子eNOS磷酸化，促進(jìn)mitoKATP開放，從而產(chǎn)生心肌保護(hù)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ATP后處理組抗凋亡因子Bcl-2顯著升高，促凋亡因子Bax減低，Bcl-2/Bax比值較對照組明顯升高，這一作用可被Wortmannin及5-HD阻斷。因此推測ATP通過激活PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路作用于線粒體KATP通道，最終可能通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

綜上所述，ATP通過激活PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)源性NO生成，然后激活線粒體KATP通道，減少兔心肌缺血再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡，減輕缺血再灌注損傷。由于ATP在體內(nèi)可迅速代謝為腺苷起作用，具有廉價(jià)、起效快、安全性高等特點(diǎn)，且藥物后處理又彌補(bǔ)了缺血預(yù)處理無法預(yù)測心肌梗死發(fā)生時(shí)間等缺點(diǎn)，因此在應(yīng)用于急性心肌梗死方面可能更加實(shí)用。本實(shí)驗(yàn)探討了ATP后處理對兔缺血再灌注損傷的心肌保護(hù)作用，為防治心肌缺血再灌注后損傷提供了理論依據(jù)。本研究PI3K-AkteNOS 信號(hào)通路中僅測定eNOS磷酸化蛋白表達(dá)，如能測定該通路各相關(guān)因子及應(yīng)用eNOS拮抗劑干預(yù)，觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，結(jié)論將更具說服力。

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ATP Post Conditioning of PI3K-Akt-eNOS Signaling Pathway Reducing the Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Experimental Rabbits

GAO Ni-ni, WANG Fang, LIAN Zhe-xun.

Department of Cardiology, The Aff i liated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao (266003), Shandong, China

LIAN Zhe-xun, Email: lianzhexun@medmail.com.cn

Objective: To explore the effect of adenosine-5'-triphosphate (ATP) post conditioning of PI3-kinase-Akt-endothelial nitric oxide synthase (PI3K-Akt-eNOS) signaling pathway reducing the myocardial ischemia reperfusion injury (IRI) in experimental rabbits.Methods:The IRI model was established in New Zealand white male rabbits and the animals were divided into 4 groups. ① Control group, the rabbits with ischemia reperfusion (IR),② ATP group, IR rabbits received ATP post conditioning, ③ Wortmannin+ATP group, IR rabbits were treated with PI3-kinase inhibitor wortmannin and ATP postconditioning, ④5-HD+ATP group, IR rabbits were treated with mitochondria ATP-dependent K+channel (mitoKATP) pathway inhibitor 5-HD and ATP post conditioning. The myocardial pathological changes were observed by HE staining, the myocardial cell apoptosis was determined by TUNEL method, the protein expressions of Bcl-2, Bax, the ratio of Bcl-2/ Bax and p-eNOS were examined by immuno-histochemistry method.Results:Compared with Control group, the ATP group showed less smaller of myocardial cell nuclear and tissue edema, reduced apoptosis index and increased ratio of Bcl-2/Bax, all P<0.01. In both Wortmannin+ATP group and 5-HD+ATP group, the size of myocardial cell nuclear and the condition of tissue edema were similar to Control group, the myocardial cell apoptosis index and the ratio of Bcl-2/Bax were similar to Control group, P>0.05. Compared with Control group and Wortmannin+ATP group, the p-eNOS protein positive expression was significantly increased in ATP group, P<0.01 and it was similar to 5-HD+ATP group, P>0.05.Conclusion: ATP post conditioning may activate PI3K-Akt-eNOS signaling pathway, work on mitoKATP pathway, to reduce cell apoptosis and IRI in experimental rabbits.

Adenosine-5'-triphosphate; Myocardial ischemia reperfusion injury; PI3k/protein kinase B/endothelial nitric oxide synthase

2013-09-04）

（助理編輯：曹洪紅）

266003山東省青島市，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科（高妮妮 、廉哲勛）；266041青島市第三人民醫(yī)院心內(nèi)科（王芳）

高妮妮碩士研究生主要研究方向?yàn)楣谛牟〉慕槿胄栽\斷及治療Email：gaoniniok@163.com通訊作者： 廉哲勛

Email：lianzhexun@medmail.com.cn

R541

A

1000-3614（2014）01-0059-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.01.016

方法:建立兔心肌缺血再灌注模型,隨機(jī)將動(dòng)物分為4組：即缺血再灌注組（對照組）、ATP后處理組、磷酯酰肌醇-3激酶抑制劑（Wortmannin）+ATP后處理組（Wortmannin+ATP組）、線粒體ATP依賴性鉀通道抑制劑5-羥葵酸（5-HD）+ATP后處理組（5-HD+ATP組）。再灌注結(jié)束后，蘇木素伊紅染色法觀察心肌病理組織變化、TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，免疫組化方法檢測心肌Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值及磷酸化eNOS（p-eNOS）蛋白表達(dá)。

結(jié)果: ATP后處理組心肌細(xì)胞核變小及細(xì)胞間質(zhì)水腫程度較對照組明顯減輕，Wortmannin+ATP組和5-HD+ATP組心肌細(xì)胞核大小及細(xì)胞間質(zhì)水腫程度與對照組相似；ATP后處理組與對照組比較，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯減低，抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；Wortmannin+ATP組和5-HD+ATP組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、Bcl-2/Bax比值與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；p-eNOS蛋白陽性表達(dá)ATP后處理組較對照組和Wortmannin+ATP組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與5-HD+ATP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

結(jié)論: ATP后處理可能通過激活PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路最終作用于線粒體ATP依賴性鉀通道，減少細(xì)胞凋亡，減輕兔缺血再灌注損傷。