（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長沙410128）

芥菜型油菜A09染色體BAC重疊群的構(gòu)建及分析

劉旭東，陸贏，劉顯軍，胡學(xué)芳，徐海鵬，劉芳瑛，劉忠松*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長沙410128）

利用定位在芥菜型油菜A09染色體上的分子標(biāo)記對芥菜型油菜（Brassica juncea）ZBjuH BAC文庫進行PCR步移篩選。共篩選出725個BAC，測定了315個BAC的末端序列，獲得564條BAC末端序列，BLAST分析表明這些末端序列對應(yīng)白菜（Brassica rapa）基因組序列支架45、支架81、支架40，支架134、支架145和支架59的同源區(qū)域，構(gòu)建了芥菜型油菜A09染色體大約6.3 Mb的BAC重疊群，為芥菜型油菜A09染色體物理圖譜構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

芥菜型油菜；染色體；BAC重疊群；PCR步移篩選

油菜包括白菜型油菜（Brassica rapa，AA＝20）、芥菜型油菜（Brassica juncea，AABB＝36）和甘藍型油菜（Brassica napus，AACC＝38）3種類型，白菜型油菜是二倍體，由白菜演化而來。芥菜型油菜和甘藍型油菜分別是由白菜與黑芥（Brassica nigra，BB＝16）和甘藍（Brassica olereace，CC＝18）天然雜交后加倍形成的異源四倍體物種，因此芥菜型油菜、甘藍型油菜中的A基因組與白菜A基因組具有相同的遺傳背景［1，2］。但是在異源四倍化形成甘藍型油菜和芥菜型油菜的過程中AABB、AACC基因組組成背景下A基因組染色體的結(jié)構(gòu)是否發(fā)生了相同的變化缺乏深入的研究［3］。芥菜型油菜和甘藍型油菜形成之后由于馴化選擇各自又分化成多個亞種，這些亞種在染色體結(jié)構(gòu)上有何不同，發(fā)生了哪些變化，這些變化在何時、什么位置發(fā)生等等問題同樣缺乏研究。

白菜是蕓薹屬植物基本種，基因組含有10條染色體，基因組大小為529 M，目前白菜已經(jīng)完成了基因組測序［4］。甘藍型油菜不僅有了轉(zhuǎn)錄組測序的報道［5，6］，而且我國已經(jīng)完成了基因組測序，目前正在進行序列組裝。芥菜型油菜基因組包含18對染色體，基因組大小約1.0 G［7］，其中A基因組包含了10條染色體。在已經(jīng)組裝的白菜基因組中，A09染色體全長約38.8 M，是A基因組中最長的染色體。A09染色體具有控制種皮顏色、硫苷合成、油脂合成等重要性狀的基因［8～13］，如TT1（類黃酮合成），TT8（類黃酮合成），MYB28（硫苷合成），F(xiàn)ATB（油脂合成）等。

BAC末端序列是高特異性序列標(biāo)記的很好資源庫?？梢詫AC末端序列進行SNP的篩查及過濾，開發(fā)的SNP標(biāo)記可以對相應(yīng)的遺傳圖譜進行加密［14］，對SNP所在的基因進行功能注釋，可以發(fā)掘其中具有重要生物學(xué)價值的基因，還可以通過對BAC末端序列中重復(fù)序列的組成、SSR分布等的分析，開發(fā)高特異性序列標(biāo)記［15］。芥菜型油菜A09染色體短臂端BAC重疊群的構(gòu)建能以BAC末端序列的排列形式展示芥菜型油菜A09短臂的簡化參考基因組，為芥菜型油菜A09染色體得到準(zhǔn)確的序列圖譜奠定了基礎(chǔ)，同時也為芥菜型油菜基因組測序后序列的拼裝提供了有效的參考。

本研究將構(gòu)建芥菜型油菜A09染色體短臂重疊群，與白菜（白菜型油菜）、甘藍型油菜A09染色體比較物理作圖以及比較基因組研究，分析蕓薹屬植物A09染色體的進化和變異（包括由多倍化所導(dǎo)致的遺傳變化，包括染色體重排、轉(zhuǎn)座、插入、基因丟失等），為油菜育種提供理論依據(jù)、基因資源和選擇方法。

1 材料與方法

1.1 材料

將從作圖群體親本（芥菜型油菜親本紫葉芥）幼葉中提取的基因組DNA進行HindⅢ限制酶不完全消化，選取改良后的pIndigoBAC536作為克隆載體進行酶切片段插入，克隆至71 808（187塊384孔板）個BAC克隆中，保存至-80℃冰箱，構(gòu)建出的BAC文庫命名為ZBjuH文庫。文庫構(gòu)建由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)羅美中教授實驗室協(xié)助完成。

1.2 方法

本研究利用PCR篩選構(gòu)建物理圖譜。利用PCR技術(shù)篩選文庫中重疊的BAC克隆，得到相互有重疊的核苷酸序列的BAC克隆，結(jié)合BAC末端測序技術(shù)，利用克隆重疊群末端的BAC末端序列設(shè)計引物，繼續(xù)對文庫進行篩選得到更多的BAC克隆，將克隆重疊群進行逐步的延伸，最終得到物理圖譜。

1.2.1 構(gòu)建3個等級的BAC混合池

ZBjuH文庫包含187個平板，每個平板有16行（編號A～P）、24列（編號1～24），每塊平板含384個（16×24）BAC克隆。單個BAC編號命名為：平板號-行-列（如：012-D-01代表的就是12號平板第四行第一列對應(yīng)的BAC克?。?。要在ZbjuH文庫71 808個BAC克隆中篩選出引物對應(yīng)的陽性克隆（理論上每條引物對應(yīng)約8個陽性克?。┻^程繁瑣，需要對篩選過程進行簡化，針對這個情況對ZBjuH文庫中的BAC克隆進行了分級。

依次提取一個平板中相鄰兩行（共48個克?。┑腄NA，混勻得到這塊平板對應(yīng)的一份（共8份）橫向三級池，命名為：平板號-行編號（如66-AB）。依次提取一個平板中相鄰兩列（共32個克隆）的DNA，混勻得到這塊平板對應(yīng)的一份縱向三級池（共12份），命名為：平板號-列編號（如66-1.2）。將一塊平板對應(yīng)的8份橫向三級池的DNA（共384個克隆的DNA）混勻，得到該平板對應(yīng)的二級池，命名為：平板號，如66號平板對應(yīng)的二級池命名為66。依次將相鄰編號的10個平板（如1～10號平板）所對應(yīng)的二級池DNA混勻，得到1份一級池（共19份，編號為1～10，11～20……180～187）。至此得到了存在逐級對應(yīng)關(guān)系的3個等級的BAC混合池。

1.2.2 陽性克隆的篩選

在3個等級的BAC混合池的基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)進行文庫篩選過程簡化至4步。第一步是對19個一級池的篩選，得到陽性一級池后（如4號一級池），對其對應(yīng)的10個二級池（4號一級池對應(yīng)31～40）進行第2步篩選，得到陽性二級池后（如38），對其所對應(yīng)的8個橫向三級池（38對應(yīng)38-AB～38-OP）及12個縱向三級池（38對應(yīng)38-1.2～38-23.24）進行第3步篩選，得到陽性三級池后（如38-AB-1.2），挑選出陽性縱向三級池和陽性橫向三級池交叉重疊位置對應(yīng)的BAC克隆，對這些克隆進行菌落PCR（第4步），得到單一陽性克隆。

1.2.3 引物的獲取

所用引物主要分為兩類。一類是已定位在芥菜型油菜A09上的分子標(biāo)記，以及參考芥菜型油菜近緣種白菜和甘藍型油菜相關(guān)序列信息開發(fā)的分子標(biāo)記；另外一類是根據(jù)已測定的芥菜型油菜BAC末端序列設(shè)計的STS引物。引物設(shè)計采用Primer premier 5軟件，設(shè)計引物時設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)為：產(chǎn)物大小200～500 bp；引物長度控制在20～23個堿基長度；正反引物Tm值均為60℃左右，GC含量盡量大于50%。

1.2.4 測序及末端序列分析

篩選到陽性克隆后，從文庫中挑選出該單一克隆，置于37℃搖床過夜培養(yǎng)，交與上海美吉或者上海立菲生物公司進行BAC末端測序。測序引物為S2和M13R，獲得BAC兩個末端的序列，分別命名為BAC-L端（對應(yīng)M13R端）和BAC-R端（對應(yīng)S2端），附帶2個末端序列對應(yīng)的測序信號峰圖。由于測序公司的技術(shù)障礙或者序列本身存在特殊結(jié)構(gòu)，需要利用chromas或sequencer軟件觀察判斷測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，如果發(fā)現(xiàn)獲得的序列長度太短（小于100 bp）或者測序信號峰圖雜亂（超過一半的堿基信號出現(xiàn)雙峰），則會舍棄這些數(shù)據(jù)，重新?lián)u菌、送樣重測。

分析用的BAC末端序列長度約為1 000 bp，去除載體序列后得到BAC的有效序列。將BAC有效序列與白菜數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)合其他BAC末端序列信息的比對情況，推測BACs之間的位置關(guān)系，對兩個BAC之間的距離、單個BAC的跨度、已構(gòu)建的BAC重疊群的延伸走向、不同BAC重疊群之間的位置關(guān)系等做出預(yù)判，這樣才能有針對性的進行下一步工作。必要時在nt（NCBI）和Repeat Masker數(shù)據(jù)庫中進行比對，分析BAC末端序列中是否包含重復(fù)序列和特殊結(jié)構(gòu)，挑選序列特異且不包含特殊結(jié)構(gòu)的末端序列設(shè)計引物進行下一輪篩選，提高末端引物篩選的成功率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAC重疊群的構(gòu)建

利用已定位在A09染色體上的引物S121-Ⅰ-1、S121-Ⅰ-2、S59-6、S134-16、S121-Ⅱ-2、B021Ⅰ11-1、H016P07-2和Niab047作為重疊群構(gòu)建的出發(fā)點，結(jié)合PCR步移篩選和BAC末端測序，對重疊群進行雙向的延伸。

本試驗共篩選出BAC克隆725個，對其中的315個BAC進行了末端測序，獲取有效BAC末端序列564條。共設(shè)計了引物467對，其中利用BAC末端序列設(shè)計引物250對，參考白菜基因組序列設(shè)計STS引物189對，參考通過RNA-seq技術(shù)獲得的芥菜型油菜種皮的非冗余基因（unigene）序列設(shè)計的STS引物21對，構(gòu)建了芥菜型油菜A09染色體物理圖長約6.3 Mb的BAC重疊群（圖1）。

將芥菜型油菜BAC末端序列與白菜基因組序列支架進行比對。圖1A展示的BAC重疊群中包含53個標(biāo)記（左起926.310／S002B15-1，右至S45-1821K），23個BAC（左起169-N-21，右至134-K -07）。該重疊群的引物序列與BAC末端序列錨定在白菜支架45（全長1 881 595 bp）上，引物序列比對在白菜支架45上的具體范圍是91 444～1 821 302，BAC末端序列的比對范圍是229 778～1 820 761，該區(qū)域BAC重疊群的物理圖長約為1.7 M。

圖1B和圖1C展示的BAC重疊群包含98個標(biāo)記（左起175-A-13R，右至S121-I-1），49個BAC（左起148-G-07，右至060-I-07），以圖1B中172-B-17為界，172-B-17以左的BAC重疊群比對在白菜支架81（全長1 190 370 bp）上，172-B-17右邊的BAC重疊群比對在白菜支架40（支架全長1 960 303 bp）上。172-B-17上的引物有的比對在白菜支架81上：S81-14（1 121 010～120 637）、S81-15（1 176 951～1 176 642），有的比對在白菜支架40上：924.330（39 183～39 319），說明172-B-17這個BAC同時包含了白菜支架40和支架81的部分片段。該區(qū)域BAC重疊群的物理圖長約為3 M。

圖1 已構(gòu)建的芥菜型油菜A09染色體短臂端BAC重疊群Fig.1 Construction of BAC contigs on the short arm of chromosome A09 inB.juncea

圖1D展示的BAC重疊群包含58個標(biāo)記（左起49M17R，右至068D18R），23個BAC（左起057-C -05，右至038-M-05），以圖1D中053-L-03為界，053-L-03以左的BAC重疊群比對在白菜支架134（全長480 632 bp）上，053-L-03右邊的BAC重疊群比對在白菜支架145（全長430 878 bp）上。053-L-03上的引物有的比對在白菜支架134上，如S134-16（403 613～403 201），有的比對在白菜支架145上，如53L03R（420 857～420 543），說明053-L-03這個BAC中插入的片段同時包含了白菜支架134和支架145的部分片段。該區(qū)域BAC重疊群的物理圖長約為0.9 M。

圖1E所展示的BAC重疊群有34個標(biāo)記（左起111N6R，右至S169-1），14個BAC（左起111-N-06，右至039-F-01）。這個區(qū)段的BAC重疊群（從左至右）在白菜基因組上的錨定位置起始于白菜支架59（全長1 410 856 bp）的大末端位置并繼續(xù)向大的方向延伸，一直到025K04開始出現(xiàn)的比對信息轉(zhuǎn)為支架169（全長287 768 bp），如025K4L（48 236～49 071）、136I09L（32 341～58 364），后續(xù)的重疊群一直延伸到S169-1（240 081～241 280）。該區(qū)域BAC重疊群的物理圖長約為0.7 M。

2.2 芥菜型油菜、白菜、甘藍型油菜的物理圖譜比較

Bancroft等利用37個TNDH株系進行轉(zhuǎn)錄本測序后，繪制了一張由23 037個SNP標(biāo)記組成的甘藍型油菜基因組遺傳圖譜。Harper等參考了甘藍基因組序列后對該圖譜進一步修正，獲得甘藍型油菜A09染色體（An9）上8 970條EST對應(yīng)的44個白菜支架的排列順序。

我們將芥菜型油菜A09染色體（Aj9）部分區(qū)段相對位置進行了拼裝排序，對比An9及其祖先種白菜的A09染色體（Ar9）支架的排序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在已分析的區(qū)域存在染色體重排、插入或缺失現(xiàn)象（圖2）。

圖2 芥菜型油菜與白菜、甘藍型油菜物理圖譜比較Fig.2 Comparison on physicalmaps ofB.juncea，B.napusandB.rapa

對比An9與Ar9的支架排列，發(fā)現(xiàn)An9和Ar9各自均有一些獨有的支架，說明在甘藍型油菜An9進化過程中發(fā)生了序列刪除或插入，An9染色體中部支架66～支架134區(qū)段發(fā)生了顯著重排。結(jié)合我們對芥菜型油菜A09染色體支架的排列順序，發(fā)現(xiàn)Aj9與An9一樣相對于Ar9發(fā)生了結(jié)構(gòu)重排，Aj9的支架134～支架135區(qū)段發(fā)生了顯著的重排，Aj9的支架59與An9上排列方向一致，不同于白菜的正向排列，支架81、支架45、支架84和支架40這4個區(qū)域在Aj9、An9和Ar9中相對保守，表現(xiàn)出高度的共線性。

3 討論

在重疊群的構(gòu)建過程中，誤差往往是伴隨著假陽性克隆出現(xiàn)的，高質(zhì)量物理圖譜構(gòu)建過程中，控制假陽性的出現(xiàn)尤其重要。出現(xiàn)假陽性克隆有以下幾種可能：（1）設(shè)計引物時沒有保證引物的特異性，引物在基因組上有多個結(jié)合位置，因此擴增出非目的片段造成假陽性。（2）瓊脂糖凝膠電泳分辨率十分有限，誤判的電泳結(jié)果會帶來假陽性。（3）菌株污染或DNA污染也會造成假陽性。正因為假陽性的存在，在重疊群構(gòu)建過程中必需遵循的原則是：當(dāng)利用一個BAC的末端序列設(shè)計的引物篩選到了另一BAC，只有反向驗證排除了假陽性，才能確定兩個BAC的相對位置，這樣才能避免BAC重疊群延伸方向發(fā)生偏差。在PCR篩選過程中，DNA混合池的濃度、PCR反應(yīng)條件、電泳條件都會對篩選結(jié)果帶來不同程度的影響，因此在嚴格控制實驗條件的基礎(chǔ)上，還需要結(jié)合已有的數(shù)據(jù)，如遺傳圖譜上連鎖標(biāo)記的相對位置，對試驗結(jié)果進行分析。

重疊群構(gòu)建過程中不可避免的會出現(xiàn)重疊群間隙，部分間隙位置的BAC末端序列及其同源的白菜序列無法對BAC重疊群的整合提供有效的參考，可以嘗試找到與該區(qū)域同源的甘藍型油菜支架序列，利用甘藍型油菜支架序列設(shè)計引物進行文庫篩選。但單一的BAC末端序列不能判斷該區(qū)域是否與甘藍型油菜支架同源，必須參考間隙區(qū)域附近已有的BAC末端序列的相對物理位置和與甘藍型油菜支架序列比對的遺傳位置，判斷兩者之間的同源關(guān)系，如果間隙位置的BACs末端與甘藍型油菜某段支架序列高度吻合，可以大膽的設(shè)想芥菜型油菜該區(qū)域位置與甘藍型油菜只是在間隙位置發(fā)生了遺傳變化，我們可以參考甘藍型油菜的支架序列設(shè)計引物達到填補間隙的目的，但是如果間隙位置相對于甘藍型油菜是發(fā)生了大片段的序列插入，那么甘藍型油菜的支架序列也無法提供有效的參考。

通過比對分析，發(fā)現(xiàn)A09染色體上有3個甘藍型油菜支架跨白菜支架，分別是甘藍型油菜支架84跨白菜支架135和支架145、甘藍型油菜支架147跨白菜支架40和支架81、甘藍型油菜支架70跨白菜支架81和白菜支架84。我們從已構(gòu)建的BAC重疊群中選取支架134與支架135、支架40與支架81交界位置的引物和BAC末端，將其分別與甘藍型油菜支架84、支架147進行了比對，比對結(jié)果顯示出高度的同源性，證明了這種參考方法的可行性。

參考白菜、甘藍型油菜基因組序列也有可能無法有效解決間隙的填補，現(xiàn)有的分析區(qū)域也依然存在未能填補的間隙，分析其原因：（1）有可能是在BAC文庫構(gòu)建過程中，這些間隙位置序列片段沒有成功插入到BAC克隆中，造成間隙位置引物無法從文庫中篩選出陽性克隆。（2）通過對間隙位置BAC末端序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)間隙位置序列一般都會呈現(xiàn)高度的重復(fù)性，難以利用這些序列設(shè)計出特異性強的引物進行延伸。（3）同時還發(fā)現(xiàn)間隙一般會位于白菜各個支架連接的位置，在白菜基因組上各支架的連接處的序列也呈現(xiàn)出相似的重復(fù)性特點。重復(fù)序列的形成是否由進化過程中大量的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)座子插入所導(dǎo)致，各個支架之間是否為轉(zhuǎn)座事件的高發(fā)區(qū)，這些問題需要進一步深入的分析。

4 結(jié)論

通過染色體步移的方法，構(gòu)建了芥菜型油菜A09染色體長約6.3 Mb的BAC重疊群，為芥菜型油菜A09染色體物理圖譜構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

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Construction and Analysis of BAC Contigs on the Chromosome A09 in Brassica juncea

LIU Xu-dong，LU Ying，LIU Xian-jun，HU Xue-fang，XU Hai-peng，LIU Fang-ying，LIU Zhong-song*

（Oilseed Crops Institute，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

In this study，markers located on chromosome A09 of B.juncea were used to screen ZBjuH BAC library by PCR walking screening.725 BACs were screened out，end sequence of 315 BACs were determined，and 564 BESs were gained.The BLAST analysis showed that those BAC contigswere corresponding to seven homologous regions of Brassica rapa’s genomic sequence，scaffold 45，scaffold 81，scaffold 40，scaffold 134，scaffold 135 and scaffold 59.The B.juncea BAC contigs，about6.3 Mb in length in total，were constructed，which provided basis for construction of physicalmap of chromosome A09 of B.juncea.

Brassica juncea；Chromosome；BAC contigs；PCR walking screening

S565.403.2；Q78

A

1001-5280（2014）03-0236-06 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.02

2014 03 02

劉旭東（1989-），男，湖南婁底人，碩士研究生，Email：349110582＠qq.com。*通信作者：劉忠松，博士，教授，Email：zsliu48＠sohu.com。

國家自然科學(xué)基金項目（31271762）。