何 陽，陳 東，汪先友，曹兵海

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

染料木黃酮對3T3-L1細(xì)胞增殖與分化的影響

何 陽，陳 東，汪先友，曹兵海

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物營養(yǎng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

試驗(yàn)旨在研究染料木黃酮對3T3-L1細(xì)胞增殖與分化的影響以及對分化過程中相關(guān)基因表達(dá)的影響。以濃度為0、10、50、100、200 μmol/L的染料木黃酮處理細(xì)胞，測定不同天數(shù)3T3-L1細(xì)胞相對增殖量、細(xì)胞合成脂肪量以及第8天與脂肪合成有關(guān)的基因PPARγ、FASN、LPL、ACC、HSL的相對表達(dá)量。結(jié)果表明：在增殖方面，染料木黃酮能顯著抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。隨著染料木黃酮濃度的增加，細(xì)胞增殖的抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)濃度為200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞停止增殖。在分化方面，染料木黃酮能顯著減少3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化合成脂肪的量（P＜0.05）。隨著染料木黃酮濃度的增加，細(xì)胞分化合成脂肪量減少。染料木黃酮能顯著減少3T3-L1細(xì)胞與脂肪合成有關(guān)的基因PPARγ、FASN、LPL、ACC、HSL的相對表達(dá)量（P＜0.05）。在濃度為50 μmol/L時(shí)，PPARγ基因相對表達(dá)量最低；在濃度為200 μmol/L時(shí)，F(xiàn)ASN基因相對表達(dá)量最低；在濃度為10 μmol/L時(shí)，LPL基因相對表達(dá)量最低；在濃度為200 μmol/L時(shí)，ACC基因相對表達(dá)量最低；在濃度為10 μmol/L時(shí)，HSL基因相對表達(dá)量最低。分析推測，染料木黃酮通過抑制與脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)來減少脂肪合成量。

染料木黃酮；3T3-L1前脂肪細(xì)胞；分化；增殖

染料木黃酮是大豆異黃酮的一種，廣泛存在于用于動(dòng)物飼料的大豆及苜蓿等豆科類植物中。它是大豆生長過程中形成的次生代謝產(chǎn)物。生物活性研究表明，大豆異黃酮特別是其中的染料木素，具有減肥、抗癌、改善心血管功能、提高機(jī)體免疫力等功效［1］。因此對染料木黃酮進(jìn)行全面的研究具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。越來越多的研究表明，具有植物雌激素作用的染料木黃酮影響動(dòng)物的脂類代謝，但影響機(jī)制還沒有徹底清楚。染料木黃酮是大豆異黃酮中含量最高的成分，也是大豆異黃酮產(chǎn)品中最有效的活性成分，具有多種生理功能［2］。目前，國內(nèi)對大豆異黃酮的研究只是停留在它的混合物的層面上，很少有對其某種單一成分進(jìn)行研究。因此，對大豆異黃酮中的染料木黃酮進(jìn)行單獨(dú)研究是十分必要的。

研究表明，染料木黃酮在抑制前脂肪細(xì)胞增殖分化作用是多方面的，染料木素是潛在的酪氨酸激酶抑制劑，由該酶催化、磷酸化的一些蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞增殖［3］。高劑量染料木素可以降低3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性［4］。目前，普遍認(rèn)為染料木黃酮抑制前脂肪細(xì)胞分化的原因是其可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和乙酰輔酶A的磷酸化水平來減少脂肪的合成［5］，但在抑制基因表達(dá)方面的報(bào)道并不多。

本研究以體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞為材料，研究不同濃度的染料木黃酮對前脂肪細(xì)胞增殖與分化合成脂肪性能的影響，從細(xì)胞和分子水平上為染料木黃酮在動(dòng)物脂肪沉積方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

染料木黃酮（>98%）購于國藥，總RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于天根生物公司（用RDNA酶處理去除RNA中的DNA），熒光定量試劑盒購于羅氏公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁。DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清購自Gibco，3T3-L1前脂肪細(xì)胞購自國家細(xì)胞資源中心。其他試劑均購自Sigma公司。

1.2 方法

試驗(yàn)根據(jù)染料木黃酮的濃度分為5個(gè)組，即G0、G10、G50、G100、G200組。在染料木黃酮粉末中加入適量DMSO溶液配成20 mmol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)向培養(yǎng)基中加入適量的儲(chǔ)備液使染料木黃酮終濃度為0、10、50、100、200 μmol/L，分別記為G0、G10、G50、G100、G200組，缺少部分用DMSO補(bǔ)齊。

1.3 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化培養(yǎng)

將匯合成單層的3T3-L1細(xì)胞消化，以104細(xì)胞/mL密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板中。匯合2 d后換用含胰島素10 mg/L，地塞米松1 μmol/L，1-甲基-3-異丁基黃嘌呤0.5 mmol/L，10%牛血清的誘導(dǎo)培養(yǎng)基 （分化第0天），分化第2天換用含胰島素10 mg/L、不同濃度的染料木黃酮分化培養(yǎng)基，第4天以后換用含不同濃度染料木黃酮的10%牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每2天換1次液。油紅0染色法測定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量［6］，用酶標(biāo)儀（Rt6100，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）在540 nm波長下的吸光度（OD值）表示脂肪含量。

1.4 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖

3T3-L1細(xì)胞以103個(gè)/mL細(xì)胞密度將細(xì)胞懸液接種到96孔板中。12 h以后換用含不同濃度的染料木黃酮DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每2天換1次液。用CCK-8試劑盒在37℃孵育1 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測得的吸光度作為細(xì)胞相對數(shù)量。

1.5 熒光定量PCR

誘導(dǎo)分化第8天的3T3-L1細(xì)胞的RNA按試劑盒說明書抽提，取2 μg總RNA按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Mx3000,美國安捷倫）。PCR引物以Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，各基因引物見表1。反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：95℃10 s，57℃15 s，72℃10 s，40個(gè)循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參基因，以2-△△Ct表示各基因的相對表達(dá)量。

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR的正向引物（F）和反向引物（R）序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本試驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)都以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。用EXCEL2007軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)；用SAS V9.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行GLM單因素方差分析，用Duncan氏法

多重比較平均值之間的差異顯著性。差異性顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 染料木黃酮對3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響

由表2可見，G0、G10和G50組的脂肪細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而顯著增加（P＜0.05）。G100組細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而上下波動(dòng)，其中第1、2和8天差異不顯著（P＞0.05），第6天和第10天也差異不顯著（P＞0.05），第4、10天以及其他天數(shù)均存在顯著差異（P＜0.05）。G200組細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)增加而上下波動(dòng)，其中第2天和第4天差異不顯著（P＞0.05），第4天和第8天差異不顯著（P＞0.05），第1天和第10天差異也不顯著（P＞0.05），其余各天數(shù)之間差異顯著（P＜0.05）。隨著染料木黃酮濃度的增加，細(xì)胞增殖數(shù)量減少。對照組和G10組在第1天顯著少于其他各組（P＜0.05），在其他天顯著高于其他組（P＜0.05）。G50組在第1、2、4天與G100組間無顯著差異（P＞0.05），在第8天和第10天存在顯著差異（P＜0.05）。G100組與G200組在第2天和第10天存在顯著差異（P＜0.05）。

表2 染料木黃酮濃度和培養(yǎng)天數(shù)對前脂肪細(xì)胞增殖數(shù)量的影響（OD值）mmol/L

2.2 染料木黃酮濃度和培養(yǎng)天數(shù)對前脂肪細(xì)胞分化中脂肪含量的影響

由表3可見，脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂肪含量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加。其中，G0、G10和G50組內(nèi)隔天存在顯著差異（P＜0.05）。G100組的第4天和第6天差異不顯著（P＞0.05），其他時(shí)間存在顯著差異（P＜0.05）。G200組的第6、8、10天差異不顯著（P＞0.05），其他時(shí)間存在顯著差異（P＜0.05）。分化第2天，G0與G10、G10與G50、G100與G200差異也不顯著（P>0.05），其他時(shí)間均差異顯著（P＜0.05）。分化第4天，G10與G50、G10與G100差異均不顯著（P＞0.05），其他時(shí)間均差異顯著（P＜0.05）。在分化第6、8和10天內(nèi)各組間均存在顯著差異（P＜0.05）。

表3 染料木黃酮濃度和培養(yǎng)天數(shù)對前脂肪細(xì)胞分化中脂肪含量的影響（OD值）mmol/L

2.3 染料木黃酮濃度對前脂肪細(xì)胞分化中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖1可見，過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）基因相對表達(dá)量隨著染料木黃酮濃度的增加出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在G0組的表達(dá)量最高，各組之間均差異顯著（P＜0.05）。脂肪酸合成酶（FASN）基因相對表達(dá)量隨著染料木黃酮濃度的增加而降低，添加組均低于對照組，各組之間均差異顯著（P＜0.05）。脂蛋白酯酶（LPL）基因相對表達(dá)量隨著染料木黃酮濃度的增加無明顯變化趨勢，添加組均低于對照組，在G10組表達(dá)量最低。乙酰輔酶A羧化酶a（ACC）基因相對表達(dá)量隨著染料木黃酮濃度的增加而降低，除G10組高于對照組之外，其他添加組顯著低于對照組（P＜0.05）。激素敏感脂肪酶（HSL）基因相對表達(dá)量隨著染料木黃酮濃度的增加而增加，但都低于對照組，其中G10組最低，各組之間均差異顯著（P<0.05）。

圖1 染料木黃酮濃度對前脂肪細(xì)胞分化中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 染料木黃酮濃度和培養(yǎng)天數(shù)對前脂肪細(xì)胞增殖數(shù)量和分化中脂肪含量的影響

關(guān)于染料木黃酮抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)理，一般認(rèn)為，染料木黃酮是大豆異黃酮的主要成分和活性成分之一，具有類雌激素作用［2］。研究表明，染料木黃酮在低劑量時(shí)具有激素樣作用可抑制細(xì)胞增殖，在高劑量時(shí)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并對細(xì)胞有毒性作用［3］；但也有研究表明染料木黃酮可以促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖［7］。染料木黃酮是潛在的酪氨酸激酶抑制劑，由該酶催化、磷酸化的一些蛋白質(zhì)參與了細(xì)胞增殖［1］。Kim等［4］研究發(fā)現(xiàn)，高劑量染料木素可以使3T3-L1前脂肪細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)研究表明，染料木黃酮的濃度為10 μmol/L和50 μmol/L時(shí)，對3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖有抑制作用；濃度為200 μmol/L時(shí)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞幾乎停止增值。推斷可能原因?yàn)樵诘蛣┝繒r(shí)，染料木黃酮對3T3-L1前脂肪細(xì)胞表現(xiàn)為雌激素作用抑制細(xì)胞增殖；在高劑量時(shí)，染料木黃酮對3T3-L1前脂肪細(xì)胞表現(xiàn)為有毒作用，使細(xì)胞停止增殖或殺死細(xì)胞。

前脂肪細(xì)胞分化過程中的一個(gè)顯著性標(biāo)志是細(xì)胞中逐漸沉積大量的脂肪。染料木黃酮作為大豆異黃酮的一種可以治療肥胖、糖尿病和心血管疾病的功效。研究顯示染料木黃酮對細(xì)胞分化合成脂肪的影響是多方面的，Zhang等［8］研究認(rèn)為，染料木黃酮減少脂肪酸合成酶的量和通過阻礙脂肪合成過程中的通路來減少脂肪合成。Harmo等［9］研究認(rèn)為，染料木黃酮通過增加增強(qiáng)子結(jié)合蛋白類似物來減少增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β，進(jìn)而減少脂肪合成。Hwang等［5］認(rèn)為，染料木黃酮可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）來增加脂肪的分解。本試驗(yàn)研究顯示，染料木黃酮對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化合成脂肪具有抑制作用，隨著添加量的增加抑制作用越明顯。這和前人研究結(jié)果相似，但也有研究認(rèn)為染料木黃酮可以增加乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成量［7］。推斷出現(xiàn)這一結(jié)果的原因是染料木黃酮不僅可以減少前脂肪細(xì)胞合成脂肪，還可以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞中脂肪的分解。

3.2 染料木黃酮濃度對前脂肪細(xì)胞分化中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

PPARγ是脂肪組織脂類代謝的重要調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)控脂肪酸的吸收和脂肪沉積，在調(diào)控脂類代謝方面起中樞作用。PPARγ參與調(diào)控脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)，在控制脂肪儲(chǔ)存和釋放、維持機(jī)體能量平衡及促進(jìn)脂肪細(xì)胞基因表達(dá)等方面均有正向調(diào)節(jié)作用［10］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，染料木黃酮可以抑制脂肪細(xì)胞中PPARγ基因的表達(dá)進(jìn)而減少脂肪的合成，但抑制程度和染料木黃酮的添加量不成正比。這和Rayalam等［11］研究結(jié)果相同。脂肪細(xì)胞分化過程會(huì)編碼大量與脂肪合成有關(guān)的酶類，F(xiàn)ASN是分化晚期的標(biāo)志物，晚期標(biāo)志物的多少及活性的強(qiáng)弱表示前脂肪細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱，它的出現(xiàn)標(biāo)志著前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的生長和生成。Zhang等［8］研究認(rèn)為，染料木黃酮可以抑制脂肪細(xì)胞中FASN蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示染料木黃酮可以抑制脂肪細(xì)胞中FASN基因的表達(dá)進(jìn)而減少脂肪的合成，抑制程度和染料木黃酮

的添加量的增加而增加?？梢奆ASN基因表達(dá)的減少是FASN蛋白減少的原因。LPL是甘油三酯降解為甘油和游離脂肪酸反應(yīng)的限速酶，與機(jī)體的脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。LPL和二?；视娃D(zhuǎn)酰酶的表達(dá)可能是終末分化時(shí)脂肪細(xì)胞脂質(zhì)大量積累的重要因素［12］。本試驗(yàn)研究顯示，染料木黃酮可以抑制脂肪細(xì)胞中LPL基因的表達(dá)。推斷原因是LPL基因的表達(dá)受PPARγ基因表達(dá)的影響，PPARγ基因的表達(dá)可以促進(jìn)LPL基因的表達(dá)。ACC在脂肪酸代謝中起重要作用，是長鏈脂肪酸生物合成中的限速酶。AMPK的激活可以提高ACC的磷酸化作用。Hwang等［5］認(rèn)為染料木黃酮可以激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和ACC的磷酸化作用，進(jìn)而減少脂肪的合成。HSL能將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸?，F(xiàn)有研究表明HSL表達(dá)量的降低能降低前脂肪細(xì)胞分化合成脂肪的量。Park等［13］研究認(rèn)為，染料木黃酮可以抑制人的前脂肪細(xì)胞合成脂肪并抑制HSL基因表達(dá)量。Pinent等［14］研究認(rèn)為，原花青素可以抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞合成脂肪并抑制HSL基因表達(dá)量。本研究結(jié)果顯示，染料木黃酮抑制HSL基因表達(dá)量，但隨著濃度升高抑制作用減弱。

4 結(jié)論

染料木黃酮可以抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖，通過減少細(xì)胞在分化過程中多種相關(guān)基因的表達(dá)量來減少脂肪的合成量。

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Effects of Genistein on Proliferation and Differentiation in 3T3-L1 Preadipocyte

He Yang，Chen Dong，CaoBing-hai，et al
（State KeyLaboraroryofAnimal Nutrition，College ofAnimal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

This experiment was designed to study the effects of genistein on 3T3-L1 cell proliferation and differentiation and its impact on the process of differentiation related gene expression.The cells were treated at the concentration of 0，10，50，100，200 μmol/L genistein，and the relative proliferation amount of 3T3-L1 cells on different days，the relative fat synthesize amount of the cells and the related genes relative expression of PPARγ，F(xiàn)ASN LPL，ACC，HSL on the 8th day were detected.The results showed that：in terms of proliferation，genistein significantly inhibited the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes（P<0.05）.The higher the concentration of genistein，the stronger the inhibition of cell proliferation.At the concentration of 200 μmol/L，the cells stopped proliferating.In terms ofdifferentiation，genistein significantlyreduced the amount of3T3-L1 preadipocytes fat synthesis（P<0.05）. With increasing concentrations of genistein，the amount of fat cell differentiation synthesis decreased.Genistein reduced significantly the expression of 3T3-L1 cell’s relative genes（PPARγ，F(xiàn)ASN，LPL，ACC，HSL）（P<0.05）.At the concentration of 50 μmol/L，the relative expression of the PPARγ gene was to the minimum.At the concentration of 200 μmol/L，the relative expression of the FASN gene was to the minimum.At the concentration of 10 μmol/L，the relative expression of the LPL gene was to the minimum.At the concentration of 200 μmol/L，the relative expression ofthe ACCgenewastotheminimum.Attheconcentrationof10 μmol/L，the relative expression of the HSL gene was tothe minimum.Analysis speculated that genistein reduced the amount offat synthesis by inhibiting the synthesis of fat-relat-

genistein；3T3-L1 preadipocytes；proliferation；differentiation

S813.1

A

2095-3887（2014）04-0026-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.04.007

2014-04-23

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-38）；南方地區(qū)草食家畜育肥與高品質(zhì)肉生產(chǎn)技術(shù)研究（201303144）

何陽（1987-），碩士研究生。

曹兵海，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛營養(yǎng)與肉品質(zhì)研究。

ed gene expression.