付 偉，任 亮，王 永，李彩霞，黃 林，林亞秋，鄭玉才

（1．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院）

藏系綿羊MSX2和HOXA4基因的克隆與序列分析

付 偉1，任 亮1，王 永2，李彩霞1，黃 林1，林亞秋1，鄭玉才1

（1．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原研究院）

對(duì)藏系綿羊的同源異型基因家族的兩個(gè)成員（MSX2和HOXA4基因）進(jìn)行克隆測序，為其功能分析奠定基礎(chǔ)。從藏系綿羊皮膚中提取總RNA，采用常規(guī)的基因克隆方法，獲得了MSX2和HOXA4基因編碼區(qū)序列，長度分別為804 bp和552 bp。序列比對(duì)顯示，MSX2基因與預(yù)測的綿羊序列存在多個(gè)堿基差異；藏系綿羊HOXA4基因與預(yù)測的山羊序列間只有1個(gè)堿基差異，但與綿羊的預(yù)測序列差異大。

藏系綿羊；MSX2基因；HOXA4基因；毛囊

藏系綿羊是我國獨(dú)特的綿羊品種之一，主要分布在高海拔的川、藏、滇等地。由于生長環(huán)境和地域的差異，藏系綿羊又可分為高原型、山谷型和山地型［1］。高原型藏系綿羊主要是生活在青藏高原地區(qū)的藏系綿羊，體型健碩，被毛異質(zhì)，主要由兩型毛構(gòu)成，具有毛辮長、彈性強(qiáng)、光澤好等特點(diǎn)，在國內(nèi)外市場尤以“西寧毛”著稱，是編織優(yōu)質(zhì)地毯的原料［2］。

同源異型基因（homeobox gene，HOX）家族包括多個(gè)成員，均含有一個(gè)高度保守的同源異型盒，用于編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。Noveen等［3］研究表明，同源異型基因家族中的MSX2基因和MSX1基因協(xié)同作用，影響皮膚的生長發(fā)育；另外的研究則發(fā)現(xiàn)，MSX2基因可促進(jìn)動(dòng)物皮膚、毛囊等的分化和形成，參與毛囊發(fā)生中的信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)動(dòng)物毛發(fā)的正常生長發(fā)育至關(guān)重要［4-6］。HOXA4基因是HOX基因家族的另外一個(gè)成員，目前對(duì)該基因的研究相對(duì)較少。有報(bào)道HOXA4基因在動(dòng)物胚胎期和胎兒的皮膚中表達(dá)［7-8］。GenBank中已有綿羊MSX2、HOXA4基因的預(yù)測序列，但尚未得到實(shí)際的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究對(duì)成年藏系綿羊皮膚中的MSX2基因和HOXA4基因進(jìn)行克隆測序，旨在比較其與普通綿羊、山羊的序列差異，為進(jìn)一步研究其功能提供資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

以生活在四川省阿壩州的成年高原型藏系綿羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，于冬季采集剛剛屠殺的母藏系綿羊腹部的皮膚樣品，去掉皮膚表皮層，用生理鹽水沖洗后立即置于液氮中凍存。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol Reagent（Ambion公司，美國），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific公司，美國），Cycle-pure Kit（OMEGA公司，美國），pMD 19-T Vector購自日本TaKaRa公司，Super Taq DNA Polymerase購自美國GeneCopoeia公司，DL2000 marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等均購自天根生化科技（北京）有限公司。

C1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Biowave紫外可見分光光度計(jì)為英國Biochrom公司產(chǎn)品；CR21G高速冷凍離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照RNA試劑盒說明書方法，Trizol法提取藏系綿羊皮膚的總RNA，紫外分光光度法測定核酸濃度。利用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit以4μg總RNA為模板，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，兩步反應(yīng)得到了cDNA第一鏈。

1.4 目的基因PCR擴(kuò)增

根據(jù) GenBank中綿羊 MSX2基因預(yù)測序列（XM_004017109） 和山羊 HOXA4基因預(yù)測序列（XM_005679274.1），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別是MSX2-F：GTCATGGCTTCTCCGTCCAAAG，MSX2-R：CGGAGTCTATTGAGCTGGTCT TCC，擴(kuò)增長度837 bp；HOXA4-F：CGAGACGACAAACTGTTAGGGC，HOXA4-R：AGGTGAGGGACAGAACTGGTCTAG，擴(kuò)增長度709bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

以反轉(zhuǎn)錄得到的藏系綿羊皮膚cDNA為模板，進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，包括10×Reaction Buffer 2.5 μL，10 mM dNTP 0.5 μL，Super Taq DNA Polymerase 0.2 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，加滅菌ddH2O至25 μL。PCR程序：95℃3 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃90 s，35個(gè)循環(huán)，72℃5 min，4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果。參照Cycle-pure Kit說明書的具體步驟純化上述PCR產(chǎn)物。

1.5 陽性克隆篩選及測序

按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法，將純化的RT-PCR產(chǎn)物與pMD 19-T Vector進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后通過PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆。每個(gè)基因選取5個(gè)陽性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。用DNAMAN4.0軟件分析測序結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏系綿羊MSX2、HOXA4基因的克隆測序

利用設(shè)計(jì)的MSX2和HOXA4基因的PCR引物，以藏系綿羊皮膚中提取的總RNA為模板，均擴(kuò)增出了特異的產(chǎn)物，長度與預(yù)期結(jié)果相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等步驟，獲得了相應(yīng)基因的陽性克隆，經(jīng)測序證實(shí)分別為MSX2、HOXA4基因，長度分別為831 bp和709 bp。

圖1 藏系綿羊MSX2、HOXA4基因的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 藏系綿羊MSX2基因序列分析

藏系綿羊MSX2基因編碼區(qū)為804 bp，與普通綿羊預(yù)測序列（XM_004017109）長度不同，它們的匹配序列（804 bp）相比存在6個(gè)堿基差異（圖2），相似性為99.25%。值得注意的是，藏系綿羊MSX2基因序列中缺失了6個(gè)堿基（435～440）。藏系綿羊MSX2基因編碼區(qū)與山羊（NM_001285601.1）長度相同，但有31個(gè)堿基不同，相似性為96.14%（圖未顯示）。

藏系綿羊MSX2基因推導(dǎo)的氨基酸序列包含267個(gè)氨基酸，理論分子量為28.976 kD，預(yù)測的理論等電點(diǎn)為10.32；與普通綿羊 MSX2基因的氨基酸序列（XP_004017158.1）相比，等電點(diǎn)不變，但存在3個(gè)氨基酸差異，并缺失了連續(xù)的2個(gè)氨基酸，相似性為98.88%（不包括缺失氨基酸，表1），差異和缺失的氨基酸均為中性氨基酸，因而不影響該蛋白的總體電荷特征。與山羊MSX2基因推導(dǎo)的氨基酸序列（NM_001285601.1或NP_001272530.1）相比，存在18個(gè)氨基酸差異，相似性為93.18%。普通綿羊預(yù)測序列（XM_004017109）比藏系綿羊MSX2基因推導(dǎo)的氨基酸序列多出77個(gè)氨基酸。

表1 藏系綿羊和普通綿羊MSX2基因推導(dǎo)的氨基酸序列對(duì)比

2.3 藏系綿羊HOXA4基因序列分析

藏系綿羊HOXA4基因的CDS區(qū)為552 bp，與綿羊預(yù)測序列（XP_004008301.1,長度657 bp）相比差異很大（圖3），但與山羊預(yù)測序列（XM_005679274.1）相比僅第146位的堿基存在差異（藏系綿羊?yàn)門，山羊?yàn)镃），相似性為99.82%。該突變導(dǎo)致了氨基酸差異，藏系綿羊?yàn)楦彼幔窖驗(yàn)榱涟彼?，氨基酸性質(zhì)差異不大。

藏系綿羊HOXA4基因推導(dǎo)的氨基酸序列編碼183個(gè)氨基酸，理論分子量為20.77 kD，預(yù)測等電為10.49。山羊HOXA4基因也編碼183個(gè)氨基酸（XM_005679274. 1），預(yù)測的理論等電點(diǎn)與藏系綿羊相同，二者僅有1個(gè)氨基酸差異，相似性為99.46%。預(yù)測的綿羊HOXA4蛋白（XP_004008301.1）則包含218個(gè)氨基酸，與藏系綿羊預(yù)測序列相比，C-末端115個(gè)氨基酸序列完全相同，而前面的氨基酸序列無法匹配。

圖2 藏系綿羊與普通綿羊MSX2基因序列比對(duì)

圖3 藏系綿羊與普通綿羊HOXA4基因序列比對(duì)

3 討論

本研究成功地克隆了藏系綿羊的MSX2和HOXA4基因，其序列與普通綿羊的預(yù)測序列相比，均存在不同程度的差異，可能與綿羊的品種或預(yù)測有誤有關(guān)。藏系綿羊MSX2基因編碼區(qū)序列與普通綿羊預(yù)測序列（XM_004017109） 長 度 不 同 ， 但 與 山 羊 序 列（NM_001285601.1）相同。三者匹配序列（804 bp）相似性較高，尤其是與普通綿羊預(yù)測序列。因此，推測普通綿羊MSX2基因預(yù)測序列在N-末端有誤。類似的問題也存在于HOXA4基因中，即預(yù)測的綿羊HOXA4蛋白（XP_004008301.1）的C-末端115個(gè)氨基酸序列與藏系綿羊完全相同，而前面的氨基酸序列無法匹配。

藏系綿羊生活在高寒、低氧的特殊生態(tài)環(huán)境中［2］，其絨毛特性對(duì)適應(yīng)特殊生態(tài)環(huán)境可能有重要作用。因此，分析與藏系綿羊毛囊發(fā)育相關(guān)的基因，對(duì)闡明畜禽與環(huán)境的互作、重要經(jīng)濟(jì)性狀的功能基因等具有十分重要的意義。本研究結(jié)果為進(jìn)一步分析MSX2和HOXA4基因的功能奠定了必要的基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequence Analysis of MSX2 and HOXA4 Genes of Tibetan Sheep

Fu Wei，Ren Liang，ZhengYu-cai，et al
（College ofLife Science and Technology，Southwest Universityfor Nationalities，Chengdu 610041，China）

The objective ofthis studywas toclone and sequence the twomembers ofthe homeoboxgene family（MSX2 and HOXA4 gene ofTibetan sheep）and provide data for their function validation.Total RNA was extracted from the skin of Tibetan sheep and the cDNA encoding MSX2 and HOXA4 was obtained by the reverse transcription PCR（RT-PCR）.The coding region of MSX2 and HOXA4 gene were 804 bp and 551 bp，respectively.Sequence alignment revealed several nucleotides difference between Tibetan sheep MSX2 gene and predicted sequence of sheep MSX2 gene；only one nucleotide difference existed between HOXA4 gene of Tibetan sheep and the predicted sequence of goat HOXA4，but Tibetan sheep HOXA4 gene showed great differences when compared with the predicted HOXA4 sequence ofsheep.

Tibetan sheep；MSX2 gene；HOXA4 gene；hair follicle

S826.8+3

A

2095-3887（2014）04-0009-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.04.002

2014-04-14

國家863項(xiàng)目（2013AA102506）

付偉（1989-），男，碩士研究生。

鄭玉才，Email:yucaizheng65@hotmail.com