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(吉林化工學(xué)院化工與生物技術(shù)學(xué)院，吉林吉林132022)

自青霉素誕生以來(lái)，抗生素一直是治療人類病原微生物感染疾病的重要武器;但是，隨著抗生素的濫用及致病菌的多藥耐藥性的產(chǎn)生，抗生素逐漸失去往日的作用效果，所以尋找新型的抗菌資源已成為備受關(guān)注的焦點(diǎn)［1］.陽(yáng)離子抗菌肽是由12-50個(gè)氨基酸組成的陽(yáng)離子型的兩親性分子.目前，已作為一種新型抗生素被廣泛研究，它們存在于動(dòng)物、植物、微生物中，是細(xì)菌、植物、低等動(dòng)物的主要防御機(jī)制［2］.在脊椎動(dòng)物中，也能夠運(yùn)用特殊的免疫方式，作為一線防御物質(zhì)，在病原微生物侵入早期抑制其生長(zhǎng)［3］.因此，陽(yáng)離子抗菌肽因其具有的陽(yáng)離子電荷和兩親構(gòu)象使其具有良好的抗菌活性，備受科研工作者的重視［4］.

利用固相態(tài)化學(xué)合成小片段陽(yáng)離子小分子多肽成本太高［5］.因此，利用畢赤酵母系統(tǒng)進(jìn)行體外重組表達(dá)的方法能夠有效降低成本［6］.該系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)［7］:(1)利用受甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶(alcohol oxidaseⅠ，AOX1)啟動(dòng)子，可嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá);(2)畢赤酵母生長(zhǎng)快速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，適合高密度培養(yǎng)，發(fā)酵后每升培養(yǎng)液細(xì)胞濕重可達(dá)450克，有利于提高目的蛋白產(chǎn)量;(3)畢赤酵母作為一種真核細(xì)胞生物，可以進(jìn)行蛋白翻譯后的加工，以使外源蛋白蛋白得到正確的折疊盒修飾;(4)該系統(tǒng)已有20多年的研究開發(fā)歷史，有多重受體菌和表達(dá)載體可供選擇，可以進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá).因此，利用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行小肽的重組表達(dá)，將有效降低生產(chǎn)成本，保證小肽的正確構(gòu)象，提升其活性.本研究利用SOE-PCR方法快速、高效的獲得了小分子多肽全基因，利用同尾酶得到基因串聯(lián)體，并將其構(gòu)建到畢赤酵母表在載體pPICZα A上，成功誘導(dǎo)出小肽的蛋白產(chǎn)物，為小分子多肽的真核表達(dá)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌種

pPICZα A 真核表達(dá)質(zhì)粒、DH5α、GS115感受態(tài)細(xì)胞為吉林化工學(xué)院生物技術(shù)研究室保存.

1.1.2 主要試劑與儀器

質(zhì)粒小量提取試劑盒(BioTeke)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(BioTeke)，限制性內(nèi)切酶XhoI、XbaI、SalI、SacⅠ(Takara)，低分子量蛋白 Marker(BioTeke)，T4 DNA 連接酶(Takara)，Taq DNA polymerase(Fermentas)，Zeocin(Invivogen)，Tricine(Sigma).PCR 儀(Bio-Rad)，電子分析天平(Sartorius)，電泳儀和電泳轉(zhuǎn)移槽(北京市六一儀器廠)，紫外可見透射反射儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad).

1.2 方法

1.2.1 KS26 基因的設(shè)計(jì)

以畢赤酵母(Pichia pastoris)的偏愛密碼子、多肽氨基酸序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)78 bp.SOE-PCR的引物均用Primer 5輔助設(shè)計(jì)，克隆引物加入酶切位點(diǎn)XhoI、XbaI，在上下游引物的3，末端設(shè)計(jì)互補(bǔ)重疊序列，在反應(yīng)體系中使兩引物互為模板進(jìn)行PCR.

1.2.2 KS26 全基因的獲取

通過(guò)SOE-PCR的方法獲取KS26全基因(78 bp).PCR程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)后72℃ 10 min結(jié)束反應(yīng).

反應(yīng)體系:10 × PCR buffer 5 μl、MgCl23 μl、dNTP 1 μl、引物 F 1 μl、引物 R 1 μl、Taq1 μl、加ddH2O 至總體積 50 μl.

1.2.3 KS26 基因的串聯(lián)

以KS26基因?yàn)榛A(chǔ)，Primer 5輔助設(shè)計(jì)，分別在上游引物和下游引物加上同尾酶 Xho I、Sal I，引物見表1.酶切連接反應(yīng)的緩沖液為:Tris-HCl(Ph 7.6)660 mmol/L、MgCl266 mmol/L、ATP 1 mmol/L、DTT 100 mmol/L、NaCl 1 mol/L.反應(yīng)體系:10 × buffer 2 μl，新鮮的 PCR 產(chǎn)物 12 μl，Xho I 2 μl，Sal I 2 μl，T4 DNA Ligase 2 μl，總體積為20 μl.酶切連接反應(yīng)條件:37℃酶切1 h;22℃連接1 h，10個(gè)循環(huán)后結(jié)束反應(yīng).

表1 KS26基因串聯(lián)引物*

1.2.4 重組載體 PICZα-KS26的構(gòu)建

KS26基因的PCR產(chǎn)物和載體pPICZα A均用XhoI、XbaI雙酶切，將膠回收后的雙聯(lián)體KS26 PCR產(chǎn)物與載體pPICZα A在T4 DNA連接酶作用下于16℃連接過(guò)夜.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，轉(zhuǎn)化平板(含 zeocin)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng).挑取單一菌落于10 μl無(wú)菌水中充分懸浮菌體，100℃裂解5 min，取1 μl作為模板進(jìn)行 PCR驗(yàn)證.將驗(yàn)證陽(yáng)性的單克隆接種于10～15 mL LB培養(yǎng)基(zeocin，終濃度為 100 μg/mL)，37 ℃，200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜，質(zhì)粒小提后，進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒交由上海生工生物工程有限公司測(cè)序部進(jìn)行DNA測(cè)序.

1.2.5 pPICZα-KS26 轉(zhuǎn)化 P.pastoris GS115(hismut+)轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定

感受態(tài) P.pastoris GS115(his-mut+)(80 μL)與 SacⅠ線性化的 pPICZα-小分子多肽(5 μg)混合，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的 0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，置冰上5 min，1.5 kV、25 μF、200 Ω 電擊 5 ms，立即加入1 mL預(yù)冷的1 mol/l山梨醇，取出200 μL涂布于MD板上，30℃培養(yǎng)2 d，通過(guò)比較轉(zhuǎn)化子在MM和MD板上的生長(zhǎng)速度來(lái)篩選Mut+轉(zhuǎn)化子.

采用PCR方法分析P.pastoris轉(zhuǎn)化子，挑取平板上的菌體，加入5 μL無(wú)菌水中，煮沸5 min，加入重新設(shè)計(jì)的鑒定引物F-tcgactcgagatgaagaaggtttcc和 R-ctgacttctagagtcgactccattg，反應(yīng)體系同上，進(jìn)行PCR反應(yīng).

1.2.6 重組子 PICZα-KS26 在 P.pastoris菌在搖瓶中的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取重組 P.pastoris，接種到 BMGY中，30℃、230 rpm/min振蕩培養(yǎng)約20 h至OD600達(dá)到2～6;室溫3000 rmp/min離心5 min，用BMMY(含1%Casaminoacids)重懸至 OD600約為1.0，30℃、250 rpm/min震蕩培養(yǎng)，進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 hr取樣，同時(shí)補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%.

1.2.7 Tricine-SDS-PAGE

取5 μl表達(dá)上清液進(jìn)行 Tricine-SDS-PAGE，凝膠采用硝酸銀染色，實(shí)驗(yàn)步驟參照Hermann的方法.

2 結(jié) 果

2.1 KS26全基因的獲取及串聯(lián)體的構(gòu)建

為了能使KS26在畢赤酵母系統(tǒng)中高效表達(dá)，我們按照畢赤酵母基因翻譯的偏愛密碼子設(shè)計(jì)合成F、R兩條互補(bǔ)引物，并使兩引物3’段的11個(gè)堿基互補(bǔ)，見表2.根據(jù)重疊PCR的原理，獲取了78 bp大小的PCR產(chǎn)物，見圖1A.

表2 KS26的氨基酸、基因和引物序列*

根據(jù)KS26全基因序列，我們重新設(shè)計(jì)了具有同尾酶Xho I、Sal I的上游和下游引物，并以SOE-PCR產(chǎn)物為模板，通過(guò)在PCR中重復(fù)完成酶切-連接的程序，成功獲得了具有Xho I、Sal I酶切位點(diǎn)的二聯(lián)體、三聯(lián)體產(chǎn)物，見圖1B.

圖1 SOE-PCR方法獲取的KS26全基因及其串聯(lián)體

2.2 重組載體pPICZα-KS26的構(gòu)建

將KS26基因進(jìn)行膠回收，其產(chǎn)物和載體pPICZα 均用 XhoI、XbaI雙酶切，用 T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli DH5α菌，篩選陽(yáng)性克隆.重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定并進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果表明目的基因正確插入，DNA自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序，序列如下:AAGAAGGTTTCCTTCAAGGTTAAGTTCAAGTCCGCTTGGGCTAAGACTGTTCATA CTGCTAAGCTGGCTCCTATTTCC.

2.3 篩選、鑒定Mut+轉(zhuǎn)化子

為了獲得更高的轉(zhuǎn)化效率和高拷貝，采用電轉(zhuǎn)化法將SacⅠ線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZα-KS26 轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115(his-mut+)，通過(guò)MM和MD板鑒定表型，大約80%的為Mut+;PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，陽(yáng)性重組子出現(xiàn)了100 bp左右的插入目的片段，與預(yù)期相符，見圖2.

圖2 重組子的轉(zhuǎn)化及PCR鑒定結(jié)果(DNA標(biāo)準(zhǔn)同圖1)

2.4 Tricine-SDS-PAGE

抗菌肽KS26的分子量只有2.9 kD，在常規(guī)SDS-PAGE系統(tǒng)中難以得到理想的分辨率，我們使用Tricine-SDS-PAGE(16%分離膠，10% 濃縮膠，4% 濃縮膠，使重組小分子多肽得到較好的分離.Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示:甲醇誘導(dǎo)表達(dá)上清在2.9 kD處出現(xiàn)一條帶，見圖3.

圖3 重組蛋白pPICZα-KS26的Tricine-SDS-PAGE電泳圖

3 結(jié) 論

抗菌肽不僅具有殺菌還具有抗病毒和抗腫瘤細(xì)胞而不破壞人體正常細(xì)胞的作用，因此在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥及食品工業(yè)中顯示出越來(lái)越多的應(yīng)用前景.陽(yáng)離子抗菌肽水溶性好，且等電點(diǎn)在8.9～10.7之間，具有較強(qiáng)的陽(yáng)離子特征，同時(shí)具有兩親α-螺旋和折β-疊片結(jié)構(gòu).陽(yáng)離子抗菌肽具有廣譜的抗菌活性，來(lái)自昆蟲、豬、蛙、人的陽(yáng)離子抗菌肽既有抗革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌的作用，又有抗真菌、抗病毒、抗腫瘤的作用［7-9］.通常研制和應(yīng)用的抗菌肽均是從昆蟲體液等天然物質(zhì)中提取，來(lái)源途徑廣泛，但含量極低，提取步驟繁雜，很難獲得大量高純度的抗菌肽.目前陽(yáng)離子抗菌肽的合成方法有化學(xué)合成和基因表達(dá)兩種.化學(xué)合成得到的樣品數(shù)量有限，而且差錯(cuò)率和副反應(yīng)隨著氨基酸數(shù)量的增多而增大，一般超過(guò)50個(gè)氨基酸的小肽很難合成.但陽(yáng)離子抗菌肽結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、氨基酸殘疾未被修飾，基因工程表達(dá)法是大量生產(chǎn)抗菌肽的理想方法［10］.本研究利用 SOE-PCR獲取抗菌肽KS26的全基因及其串聯(lián)體并構(gòu)建了真核畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建到進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，為快速、高效的進(jìn)行小肽重組表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)進(jìn)行了有益的探索，有效地解決了小片段氨基酸合成成本過(guò)高的問(wèn)題，將為短肽的規(guī)模化生產(chǎn)提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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