馬夢婷，蔡 武，魏武軍，陳曉莉，高慶華

（1.新疆生產(chǎn)建設兵團畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；2.新疆阿合奇縣畜牧獸醫(yī)局；3.新疆和田縣畜牧獸醫(yī)局)

牛超低劑量性控分選冷凍精液人工授精試驗

馬夢婷1，蔡 武2，魏武軍3，陳曉莉1，高慶華1

（1.新疆生產(chǎn)建設兵團畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300；2.新疆阿合奇縣畜牧獸醫(yī)局；3.新疆和田縣畜牧獸醫(yī)局)

試驗旨在檢驗使用超低劑量牛性控分選冷凍精液人工授精的效果。將180頭牛分為3組進行人工授精，常規(guī)冷凍精液組（C，n=60）和經(jīng)流式細胞分離的兩種劑型（X1，n=60；X2，n=60）的X冷凍精液組，常規(guī)凍精有效精子數(shù)（1 125.1±109.4）×104，X1型和X2型凍精有效精子數(shù)分別為（102.3±9.6）×104和（51.9±4.8）×104。結果顯示：X1型凍精和X2型凍精的90 d受胎率分別為53.3%和47.7%，低于常規(guī)凍精組的66.7%（P＜0.05)；X1型凍精和X2型凍精組母犢率分別為93.8%和100%，明顯高于常規(guī)凍精組的43.9%（P＜0.05）。兩種劑型X凍精和常規(guī)凍精配種所產(chǎn)犢牛出生重分別為33.7 kg±5.2 kg和34.4 kg±4.5 kg，差異不顯著（P>0.05）；母牛妊娠期均在270～300 d的正常范圍內(nèi)。

奶牛；超低劑量分選精液；人工授精；產(chǎn)母犢率

控制減少雄性出生，增加雌性后代的比例，對快速增加良種牛數(shù)量有十分重要的意義［1-2］。目前，流式細胞分離精子授精是控制哺乳動物性別最為可靠的技術［3］。牛精子易于分選和冷凍，牛性控凍精已商業(yè)化，國內(nèi)每支含2.3×106個精子（含有效精子1×106）的0.25 mL牛細管凍精的售價在150～300元人民幣，其純度和密度基本可以滿足低劑量輸精的要求［4-5］。但是，受專利和生產(chǎn)成本的限制，分選性控精液的高成本在今后相當長的時間內(nèi)是限制其廣泛用于生產(chǎn)的一個主要因素［2］，而通過提高性控精液的利用效率是當前降低成本的最重要途徑。在奶牛、馬鹿、梅花鹿和奶山羊性控精液的試驗研究中，都曾有過使用了5.0×105甚至更低數(shù)量有效精子的輸精劑量，這些試驗已經(jīng)獲得了正常受胎率和預知性別的后代［6-7］，關鍵是要在生產(chǎn)中掌握精準的授精時間、輸精部位，并結合輸精前的促排技術。

1 材料與方法

1.1 材料

新疆和田縣和阿合奇縣4個農(nóng)業(yè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)體況良好的青年雜交母牛180頭；冷凍精液購自XY公司，3頭公牛號為11035、03162、10203，每頭公牛的X型冷凍精液采用0.25 mL細管分裝，為2.5×106和1.2×106兩種劑型，常規(guī)冷凍精液采用0.25 mL細管分裝，為2.5×107/管，凍精活率均≥0.4，液氮保存；顯微鏡，胚胎移植槍及耗材（法國卡蘇），液氮罐，磅秤。

1.2 方法

試驗在2011年和2012年的4—6月進行，180頭青年雜交母牛被分為X1、X2、C三組；觀察牛的發(fā)情情況，以母牛爬跨其他母牛，同時接受其他母牛爬跨，并有吊線為發(fā)情特征，每天至少觀察發(fā)情4次并記錄；凍精細管在37℃溫水中解凍，每組各取12個解凍細管樣本，采用血球計數(shù)板間接法測定有效精子數(shù)（單位：104精子）。

C組60頭當?shù)厍嗄昴概２捎贸Ｒ?guī)冷凍精液，在首次觀察到發(fā)情牛穩(wěn)定接受爬跨后12 h以1管常規(guī)凍精劑量進行一次人工授精，授精部位在子宮體；對120頭當?shù)厍嗄昴概２捎肵型冷凍精液人工授精，時間為首次觀察到發(fā)情牛接受爬跨后16 h，輸精前直腸檢查卵泡發(fā)育情況，在優(yōu)勢卵泡側子宮角深部用胚胎移植槍進行一次直腸把握授精，3頭公牛的兩種劑型的X凍精間隔交替使用，每次1管性控冷凍精液；授精使用2.5×106劑型為X1組（60頭），1.2×106劑型為X2組（60頭）。人工授精后對90 d不返情母牛直腸檢查定胎，統(tǒng)計情期受胎率（%），產(chǎn)犢后統(tǒng)計母犢率（%），妊娠時間（d），并測量其初生體重（kg）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

有效精子數(shù)均數(shù)及標準差，90 d受胎率和產(chǎn)母率進行χ2檢驗，初生重和妊娠期數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 分選凍精和常規(guī)凍精人工授精結果比較

由表1可看出，每管X1凍精（0.25 mL）與每管X2凍精（0.25 mL）解凍后精子活力和有效精子數(shù)相比差1倍，其中X1凍精與常規(guī)凍精的有效精子數(shù)相差10倍。X1型凍精人工授精90 d受胎率為53.3%，X2型凍精90 d受胎率為47.7%，常規(guī)凍精為66.7%，X2型凍精人工授精90 d的受胎率低于X1型的，而X1型凍精人工授精90 d的受胎率又低于常規(guī)凍精的。X1型凍精和X2型凍精性控精液產(chǎn)母率分別達93.8%和100%，遠偏離對照43.9%的母犢率。

表1 分選X型凍精和常規(guī)凍精人工授精結果對比

2.2 分選X型凍精和常規(guī)凍精所產(chǎn)母犢牛比較

由表2可看出，經(jīng)流式細胞分離的X型和常規(guī)冷凍精液經(jīng)人工授精，測量其后代出生重無顯著差異（P>0.05），經(jīng)X型凍精和常規(guī)凍精人工授精的母牛妊娠期都在270～290 d的正常范圍之內(nèi)。

表2 分選X型凍精和常規(guī)凍精所產(chǎn)母犢牛出生體重和妊娠期

3 討論

超低劑量輸精是本試驗的主要特點，試驗結果中兩種低劑量性控精液的情期受胎率分別為53.3%和47.7%，雖比常規(guī)精液的情期受胎率（66.7%）低，但在生產(chǎn)中可以接受，性控效果達93%以上，并且妊娠期和胎兒出生情況與常規(guī)精液后代相比都正常。這個試驗證明了采用商品性控凍精半劑量授精的可能性。

Seidel等發(fā)現(xiàn)在奶牛上采用低劑量或超低劑量輸精也可達到常規(guī)70%的情期受胎率［7］，而對于我國農(nóng)村鄉(xiāng)鎮(zhèn)牛場情期受胎率如能夠達50%則較為滿意，此次試驗兩種低劑量性控精液的情期受胎率分別為53.3%和47.7%。

當前推廣分選的性控精液有兩個主要問題：性控精液成本較高和情期受胎率低［2］。X型精液輸精一次約200元，受胎1頭約需要500元，遠高于常規(guī)凍精的成本，但X型精液受機器分選效率的限制、專利使用費和市場因素的影響，其價格不會有大的下降，所以在保持情期受胎率基礎上降低輸精劑量是推動該技術更廣泛應用的一個有效途徑。

分離過程對精子會造成更多的損傷，而精子DNA的損傷可能會影響受胎率與后代的遺傳穩(wěn)定性［8-9］。已經(jīng)有相當多的試驗證實：同樣劑量的性控凍精與常規(guī)凍精的受胎率沒有差異，這說明不會顯著影響受胎效果［9-10］。本試驗中性控精液產(chǎn)母率達93%以上是令人滿意的。X型精液人工授精后所產(chǎn)母犢早期出生重和懷孕期與常規(guī)凍精生產(chǎn)的后代沒有差異，初步證明應用這個技術出生的性控后代的表型是正常的。

用分離X和Y精子的性控精液進行人工授精是控制家畜性別之最簡單可行的方法。然而,低密度性控精液輸精效果還不如常規(guī)人工授精,許多技術環(huán)節(jié)都有待改進［11-12］。挑選能夠熟練從事胚胎移植操作技術的輸精員，精確控制人工授精各個技術環(huán)節(jié)可以縮小性控與非性控、低密度與高密度精液之間的差別，獲得高妊娠率。

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S823.3

A

2095-3887（2014）02-0022-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.02.007

2013-12-31

兵團博士資金項目（2010JC20）；兵團科技攻關計劃課題（2011AB065）

馬夢婷（1991-），女，碩士。

高慶華（1970-），男，教授，博士。主要研究方向：動物胚胎工程。