曹 波 張紅濤 朱亞婷 馬媛媛

（新疆醫(yī)科大學厚博學院，新疆 烏魯木齊830054）

食管癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，我國男女性食管癌患病率和死亡率均居世界之首位，且近年來仍呈現(xiàn)上升趨勢。食管癌患病率因地區(qū)變化而顯著不同，在我國新疆哈薩克族是食管癌的最高發(fā)民族之一，其食管癌死亡率達155.9/106，高于我國平均水平15.23/106，嚴重威脅著哈薩克族人民的身心健康。早期診斷不僅可以明顯提高食管癌患者的生存率，而且對于提高病人的生活質(zhì)量、節(jié)約衛(wèi)生資源以及維護社會安定等均有重要意義。

1 研究對象

采用問卷調(diào)查、家訪、醫(yī)院病案資料整理分析及病理學檢查等方法，對新疆內(nèi)哈薩克族食管癌病人資料進行收集整理，共收集50例癌患資料，資料主要來源于當?shù)財?shù)家醫(yī)院及相關(guān)腫瘤登記機構(gòu)，所有病人均經(jīng)組織病理學證實。選取本實驗室收集50例單發(fā)食管癌和賁門癌手術(shù)切除標本，將每例標本進行連續(xù)取材，全部石蠟包埋，每個蠟塊均進行切片、HE染色，再次鏡下觀察、記錄，篩選漏診的雙源癌，共檢出112例，將所有收集到的臨床資料錄入Excel表，使用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，檢驗水準采用阿爾法=0.05。

挑選50例臨床資料齊全的血清標本（25例食管癌病人和25例正常），全部研究對象取清晨空腹非抗凝靜脈血5mL，靜置30min后，4℃1600轉(zhuǎn)離心5分鐘分離血清，將血清放置EP管-20℃保存待用。根據(jù)提取的miRNA量，部分樣品做了技術(shù)重復以進一步消除隨機誤差。

2 材料與方法

2.1 主要化學試劑

表1

血清miRNA的提取一苯酚氯仿抽提體系；RT-PCR反應體系；SPSS 13.0軟件；microRNA芯片分析儀。

2.2 方法

利用一苯酚氯仿抽提法抽提正常組別和對照組別的血清RNA，利用PCR技術(shù)進行擴增，microRNA芯片技術(shù)分析血清miroRNA表達譜。qRT-PCR技術(shù)檢測的標準曲線的重復性，數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。

食管癌與正常對照比較篩選的結(jié)果食管癌與正常對照比較可篩選到12個表達呈上調(diào)趨勢的miRNA(fold change＞1.5)，這些上調(diào)表達的 miRNA分別為 hsa.miR.320b st、hsa.miR.320c st、hsa.miR.320a st、hsa.miR.92a st、hsa-miR-486-5p st、hsa-miR一 627 st、hsa-miR.365 st、hsa.miR.1 826 st、hsa-miR-923 st、hsaomiR-l 85 st、hsa-miR.129。star st和hsa.miR.106a.star st，表達倍數(shù)1.5192.3.8319

3 討論

食管癌目前漏診率很高，患者5年生存率差，有效的術(shù)前診斷手段就是胃鏡+活檢，除了常規(guī)查體發(fā)現(xiàn)早期，大部分患者均是有了吞咽困難等消化道癥狀后才會去檢查，此時腫瘤已經(jīng)發(fā)展到了中晚期，錯過了最佳的手術(shù)治療時間，而早期診斷和治療有效的降低癌的死亡率，改善生存狀況。所以探索發(fā)現(xiàn)癌的早期診斷生物標記物，可以對對高危人群進行篩查，有助于早期發(fā)現(xiàn)癌。

一般來說，特異的生物標記物有三種不同的用途，首先，它能區(qū)分疾病與正常狀態(tài)；其次它能用來指導預后；還能用來進行治療或檢測治療反應。檢測血中特異的miRNA作為一種生物標記物用來區(qū)分惡性腫瘤和正常有著廣闊的應用前景，可以提高惡性腫瘤患者非侵入性檢查的早期診斷率，改善患者的生存時間。越來越多的研究證據(jù)表明miRNA與各種惡性腫瘤的關(guān)系密切，成為腫瘤研究領域的熱點之一。有文獻報道m(xù)iRNA可能會對癌癥的診斷、預測及治療開辟了一條新的途徑；而且miRNA高表達譜與食管癌患者的低生存率有關(guān)，其中miR.129的高表達被認為在外科手術(shù)治療的食管鱗癌患者中是一個獨立而重要的預后影響因子；也有人認為miRNA在組織和血液中的表達譜在結(jié)腸癌的檢測、篩查和監(jiān)測中都有潛在的應用價值，而且，miRNA可能會成為結(jié)腸癌基因治療的一個靶點；miRNA表達譜改變可以區(qū)分食管腫瘤的組織學類型、正常與癌組織，而且能鑒別出有癌變傾向的Barrett食管。miRNA廣泛存在于生物體內(nèi)，具有強大的調(diào)控基因表達的作用，miRNA主要采用降解靶mRNA和抑制靶mRNA的翻譯兩種作用方式調(diào)控基因的表達，而且有調(diào)節(jié)生長發(fā)育和維持機體正常生理功能等均有重要作用，正常人血漿微泡表達的miRNA能夠預測血細胞的分化和代謝通路及重要的免疫調(diào)節(jié)機制，為miRNA在疾病中的預測作用奠定了基礎。有研究證據(jù)都顯示，miRNA可以作為一類新的腫瘤“原癌基因”或者腫瘤“抑癌基因”。若這些miRNA表達在腫瘤中升高，就被看作癌基因，它們通過促進腫瘤增殖或者抑制腫瘤抑制基因，調(diào)控腫瘤細胞的增殖和凋亡。miR.17.92是原癌miRNA的一個典型例子，它是定位于人13q31的多順反子miRNA，這一區(qū)域的基因參與了包括惡性淋巴瘤、肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生。另外一些miRNA的表達在腫瘤細胞中有所降低，腫瘤抑帶IJmiRNA通常通過抑制原癌基因控制細胞分化和凋亡，進一步抑制腫瘤的發(fā)展，1let.7在肺癌中的表達降低，患者的生存期縮短，這說明let.7可能是一個腫瘤抑制基因。miRNA表達譜芯片的原理簡單地說就是把待測樣品中的miRNA與芯片上互補的探針序列雜交，通常待測樣品中miRNA的端會標記上熒光基團，雜交洗滌后掃描熒光強度，大量數(shù)據(jù)經(jīng)處理后便可篩選出有顯著表達差異的miRNA，這些“脫穎而出”的群體就是要瞄準的研究對象了?；蛐酒咄康奶攸c，使得miRNA芯片非常適合檢測miRNA表達譜。miRNA芯片分析可以幫助了解腫瘤組織和正常組織中miRNA表達的關(guān)系?；诖思夹g(shù)，一些作為原癌基因和腫瘤抑制基因的miRNA被分離鑒定出來，這將有助于理解在腫瘤發(fā)生中miRNA的作用，同時也為尋找腫瘤特異性診斷的標志物提供了依據(jù)。

我們通過昂飛的miRNA芯片雜交掃描得到的雙源癌與正常對照比較的miRNA表達譜，共有12個表達上調(diào)的miRNA，與食管癌比較的miRNA表達譜也是12個上調(diào)、1個下調(diào)，與賁門癌比較的miRNA表達譜有11個上調(diào)，3組表達譜同時有8個miRNA表達上調(diào)，這8個miRNA組成的表達譜對癌的診斷有一定價值，進一步進行大范圍的驗證及研究其功能和相關(guān)的基因表達調(diào)節(jié)機制，將會對癌發(fā)病機制的探討和早期診斷起到重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)在網(wǎng)織紅細胞終末分化過程中miR.320的下調(diào)在CD71(鐵傳遞蛋白受體)中起著重要作用，而CI)71是一個反映分化程度的標志，見于早幼紅細胞、網(wǎng)織紅細胞，成熟紅細胞無表達。更進一步的調(diào)查發(fā)現(xiàn)miR.320在純合子鐮狀細胞病的細胞中低表達和CD71在終末分化過程中的缺陷低調(diào)節(jié)有關(guān)。

我們發(fā)現(xiàn)癌里hsa.miR.320b st、hsa.miR.320c st、hsa.miR.320a st均有較明顯的高表達，是否與CD71的調(diào)節(jié)有關(guān)還需進一步的研究。miRNA在癌癥中的發(fā)生中起著重要的作用，因為超過50%的miRNA基因位于癌癥相關(guān)的基因組區(qū)域，他們在各種癌癥中出現(xiàn)錯調(diào)現(xiàn)象，最新版本的miRBasel4.0(SangermicroRNA序列數(shù)據(jù)庫)它的共收錄10，581條成熟的miRNA序列信息，共涵蓋115個物種，人類miRNA共721條。為了深入研究這些miRNA的功能，首先需要我們能夠準確、快捷地檢鋇,UmiRNA在不同組織、不同發(fā)育階段以及各種生理狀態(tài)下的表達情況。當前研究miRNA表達的方法有克隆測序、RNA印跡、RT.PCR和RNA酶保護分析等，但對于腫瘤研究，需要大規(guī)模比較腫瘤組織和正常組織中的miRNA表達譜差異，以上的方法耗時耗力，檢測的通量不高。在miRNA水平高通量檢測基因表達的生物芯片技術(shù)在20世紀90年代發(fā)展以來，發(fā)展到今天已經(jīng)非常成熟，并在基因表達檢測方面得到了廣泛應用。

芯片技術(shù)的應用實現(xiàn)了在全基因組水平鑒定成熟miRNA的表達，可于短時間內(nèi)同時鑒定所有已矢NmiRNA的表達譜，成為高通量檢測的最佳選擇。隨著計算機技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，miRNA功能的研究更先進，可能逐一找到miRNA的靶基因，從而揭示它們的功能。

研究人員已經(jīng)設計出多種miRNA靶基因預測軟件，如mirBase，miRanda，targetscan，Pictar等對miRNA靶基因預測具有較高的準確性，為了減少假陽性的情況，只有推定靶基因預測至少有三個項目被接受。該基因的功能的闡釋是通過基因本體 Biocarta，KEGG，和GenMAPP數(shù)據(jù)庫等來進行。對此，我們將在后續(xù)實驗中針對篩選出來的雙源癌差異表達各種miRNA，在較大的樣本中采用實時定量PCR方法加以驗證，結(jié)合患者的臨床病理資料分析其臨床意義，并在體內(nèi)外實驗進一步研究相關(guān)miRNA的生物學功能。

4 結(jié)論

hsa-miR·320b—st、hsa-miR-320c-st、hsa—miR·320a—st、hsamiR一92a—st、hsa·miR-486-5p_st、hsa-miR-627-st、hsa-miR-365-st和hsa-miR-1826-st等miRNA較對照組明顯上調(diào)表達，可能癌診斷標記物的探索和發(fā)病機制的探討有一定價值。

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