敖曉琳，蒲 彪，蔡義民，陳 岑，胡愛華，陳安均（.四川農(nóng)業(yè)大學，食品學院，四川雅安6504；.日本國際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心，日本茨城305-8686）

能抑制引起泡菜“生花”腐敗菌的乳酸菌的篩選

敖曉琳1，蒲 彪1，蔡義民2，陳 岑1，胡愛華1，陳安均1
（1.四川農(nóng)業(yè)大學，食品學院，四川雅安625014；2.日本國際農(nóng)林水產(chǎn)研究中心，日本茨城305-8686）

從優(yōu)質(zhì)泡菜水中分離出的7株乳酸菌用于對引起泡菜生花的4種腐敗菌進行抑菌實驗，通過牛津杯法、液體培養(yǎng)（產(chǎn)膜、沉淀、液體混濁度），以及乳酸菌的發(fā)酵上清液對腐敗菌抑菌率的測定，篩選出具有較強抑制4種腐敗微生物生長和代謝的菌株SCP53（Lactobacillus plantarum）。將乳酸菌SCP53與腐敗菌共同接種發(fā)酵蘿卜，結果證實該菌株確實能起到抑制泡菜生花，改善泡菜品質(zhì)的作用。

泡菜，乳酸菌，腐敗菌，抑菌能力，篩選

泡菜以酸、香、脆、嫩的特點受到廣大消費者的喜愛。在泡菜的生產(chǎn)過程中，由于蔬菜原料不容易滅菌，殘留的有害微生物常引起泡菜的腐敗變質(zhì)。“生花”是最常見的腐敗現(xiàn)象之一，泡菜一旦生花，不僅表面會出現(xiàn)白膜，而且會伴隨著餿臭味或腐敗味，菜品軟爛，泡菜汁渾濁。本實驗室前期研究已證實引起泡菜“生花”的微生物主要為酵母菌和芽孢桿菌，其中Pichia manshurica和Candida tropicalis在酸性條件下容易形成膜，是導致泡菜在貯藏過程中生花的主要微生物，而芽孢桿菌若在發(fā)酵前期污染嚴重，常導致泡菜樣品色變、湯汁渾濁，促進生花現(xiàn)象的發(fā)生[1]。生產(chǎn)廠家常通過滅菌和添加防腐劑的辦法來控制腐敗菌的生長。但是滅菌通常會使泡菜變軟，而添加防腐劑不僅會將乳酸菌部分殺死，而且會影響泡菜的整體風味[2]。大多數(shù)學者都是通過外來添加物來抑制發(fā)酵蔬菜中生花腐敗菌的生長，例如韓國的學者通過添加大蒜油來抑制韓國泡菜中酵母菌的產(chǎn)膜，美國的學者通過添加（E）-3-已烯酸和已酸來取代山梨酸抑制泡菜水中酵母菌的生長[3-4]。而通過乳酸菌的生長代謝抑制引起“生花”的腐敗菌的研究較少。

乳酸菌是引起泡菜良性發(fā)酵的主要微生物，在泡菜發(fā)酵過程中起著主導作用。優(yōu)良的乳酸菌可通過自身的生長繁殖以及代謝產(chǎn)物（有機酸、雙乙酰、過氧化氫、細菌素等）的作用來抑制腐敗菌的生長和代謝，而“生花”現(xiàn)象主要是腐敗菌在有氧條件下的代謝產(chǎn)物所導致[4]，因此通過篩選具有抑制引起泡菜生花腐敗菌的乳酸菌菌株，可以控制泡菜生花現(xiàn)象的發(fā)生，改善產(chǎn)品品質(zhì)，延長商品的貨架期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌（7株） 分離自四川自然發(fā)酵的優(yōu)質(zhì)泡菜樣品[6]，菌株編號分別為：SCP09（Lactobacillus brevis）、SCP15（L.plantarum）、SCP21（L.plantarum）、SCP27（L.fermentum）、SCP49（L.plantarum）、SCP53（L. plantarum）、SCP57（L.plantarum），NCBI登陸號為AB617645-AB617651；腐敗菌（4株） 1P-1、4P-2、3P-1、1P-2，經(jīng)菌種鑒定分別為Pichia manshurica、Candida tropicalis、Bacillus subtilis、Bacillus altitudinis[1]；PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基 用于腐敗真菌的活化、培養(yǎng)和計數(shù)；NA（營養(yǎng)瓊脂）培養(yǎng)基 用于腐敗細菌的活化、培養(yǎng)和計數(shù)；MRS培養(yǎng)基 用于乳酸菌的活化和培養(yǎng)；其余試劑 為分析純。

PYX-DHS-60×75型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海浦東榮豐科學儀器有限公司；pH4-C+型酸度計 成都世紀方舟科技有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；SYQ-DSY-280B型高壓滅菌鍋 上海善志儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌上清液的制備 乳酸菌經(jīng)活化后，按0.1%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，8000r/min，離心1min，取上清液備用[7]。

1.2.2 指示菌菌液制備 將供試腐敗菌反復三次接種到相應的液體培養(yǎng)基中活化后，細菌和酵母菌均按0.1%的接種量分別接種到營養(yǎng)肉湯和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，細菌37℃，酵母菌28℃培養(yǎng)24h，調(diào)整菌體濃度為108CFU/mL備用。

1.2.3 抑菌圈的測定（牛津杯法） 將配制好的瓊脂空白培養(yǎng)基倒入滅菌的平板，每個10mL，待培養(yǎng)基凝固后；移取指示菌菌液至45℃的PDA（酵母菌）或NA（細菌）培養(yǎng)基，使菌液濃度為105CFU/mL，混勻，取15mL培養(yǎng)基倒入鋪有空白瓊脂的平板中。用鑷子將已滅菌的牛津杯（內(nèi)徑6mm）放入平板對稱四個點上，用移液槍向牛津杯中加入乳酸菌上清液50μL，牛津杯中加入MRS液體培養(yǎng)基作為對照，細菌37℃，酵母菌28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，記錄抑菌圈的大小。將抑菌能力較強的菌株用于后續(xù)抑菌效果和抑菌率的測定[8]。

1.2.4 乳酸菌上清液對腐敗菌抑菌效果的測定 將指示菌按照0.1%的接種量接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基或營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，分裝5mL于滅菌的試管中，分別加入500μL各種乳酸菌上清液作為實驗組，以加入MRS液體培養(yǎng)基的試管作為對照，28℃或37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察指示菌在試管中的生長現(xiàn)象（產(chǎn)膜，混濁度，沉淀）。

抑菌率的測定：將觀察現(xiàn)象后的培養(yǎng)液經(jīng)梯度稀釋至10-2～10-6后，涂布于PDA或NA平板中，用于測定培養(yǎng)液指示菌的含量，以計算不同乳酸菌上清液對不同指示菌的抑菌率。抑菌率的計算公式[9]：

抑菌率（%）=（對照組指示菌菌落數(shù)-實驗組指示菌菌落數(shù)）/對照組指示菌菌落數(shù)×100

1.2.5 篩選出的乳酸菌在泡菜發(fā)酵過程中的抑菌能力 將篩選出的具有明顯抑菌作用的菌株與一種腐敗菌共同接種于自然發(fā)酵的泡菜樣品中，只接種腐敗菌的樣品作為對照，用于測試乳酸菌在泡菜環(huán)境中抑制相應腐敗菌的能力。

操作流程：將新鮮水蘿卜清洗、晾干、切分之后稱重，每100g樣品加入150mL無菌水，加入總量4%的食鹽后，實驗組接種乳酸菌和一種腐敗菌各103CFU/mL，對照組只接種相應的腐敗菌103CFU/mL，密封。樣品于25℃條件下發(fā)酵1周。結果記錄主要包括生花程度、顏色、發(fā)酵液渾濁度。

2 結果與分析

2.1 牛津杯法測定乳酸菌對腐敗菌的抑制結果與分析

從表1乳酸菌對腐敗菌的抑制結果來看，供試7株乳酸菌對芽孢桿菌3P-1和1P-2抑菌效果較好，均能產(chǎn)生不同程度的抑制。乳酸菌SCP53和SCP27產(chǎn)生的抑菌圈最大，因此兩株菌能有效抑制供試腐敗芽孢桿菌的生長，其次抑制效果較佳的為菌株SCP21。從對酵母菌1P-1和4P-2的抑制效果來看，多數(shù)乳酸菌對這兩株菌不具有抑制能力，只有乳酸菌SCP27和SCP53對其有一定的抑制能力，而SCP21只對4P-2有一定的抑制作用。

多數(shù)乳酸菌的抑菌能力來自于其產(chǎn)生的乳酸。產(chǎn)酸能力強的乳酸菌通常具有很好的抑制雜菌生長的能力，尤其是對耐酸性不強的菌株。對于芽孢桿菌而言，雖然其生命力旺盛，不容易被徹底除去，但是其在酸性條件下的存活能力大大下降[10]。供試乳酸菌全為乳酸桿菌，都具備較強的產(chǎn)酸能力，尤其是植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力在乳桿菌中是較強的，是蔬菜發(fā)酵過程中最常用的菌株種類，所以體現(xiàn)出對芽孢桿菌較強的抑制效果。然而對于酵母菌而言，雖然供試的酵母菌分屬畢赤酵母屬和假絲酵母屬，但是都能在酸性條件下生存，是酸性產(chǎn)品中的主要腐敗微生物，能分解乙醇、乳酸、醋酸為二氧化碳和水，因此僅靠乳酸菌產(chǎn)酸是很難將酵母菌大量抑制的[11]。有些乳酸菌能產(chǎn)生H2O2、雙乙?；蛞志仡愇镔|(zhì)，可能對酵母菌的生長有一定的抑制作用。

2.2 乳酸菌對腐敗菌在液體條件下生長的抑制效果與分析

表1 牛津杯法測定乳酸菌對腐敗菌的抑制效果Table 1 The inhibition of lactic acid bacteria to spoilage microorganisms by Oxford cup method

泡菜生花主要是腐敗微生物生長代謝產(chǎn)生的結果，泡菜一旦生花后，常表現(xiàn)出表面成膜、汁液渾濁、沉淀等現(xiàn)象。利用三株抑菌作用較強的乳酸菌用于測定在液體生長狀態(tài)下對腐敗菌的抑制作用，從表2結果來看，乳酸菌上清液的加入對供試腐敗菌的產(chǎn)膜有較大程度的改善。乳酸菌SCP53對菌株1P-2和3P-1的產(chǎn)膜、沉淀、渾濁等現(xiàn)象都能有效抑制。對于菌株1P-1和4P-2，乳酸菌對其產(chǎn)膜有一定的抑制，其中乳酸菌SCP53的抑制效果最佳，4P-2無膜出現(xiàn)，但是1P-1還是有輕微的膜存在。因此，在液體條件下，腐敗芽孢桿菌受到乳酸菌代謝產(chǎn)物的影響，生長代謝被抑制，腐敗現(xiàn)象明顯改善。然而腐敗的酵母菌因不能完全被抑制，所以還是會呈現(xiàn)出不同程度的產(chǎn)膜、沉淀以及渾濁的現(xiàn)象。

為了考察乳酸菌對腐敗菌生長量的抑制，測定了乳酸菌對腐敗菌的抑制率（表3）。從表3可以看出，SCP21上清液對3P-1抑制效果明顯，能抑制95.86%的菌株生長；SCP27能明顯抑制菌株1P-2和3P-1的生長，抑制率達到99.85%和93.97%；SCP53對1P-2和3P-1的抑制率分別達到98.91%和99.45%。從百分比可得，三株乳酸菌對芽孢桿菌的抑制率都大于90%。從對酵母菌的抑制效果可得，SCP21對菌株1P-1和4P-2的抑菌率都較低，與表2中的現(xiàn)象相吻合。SCP27對兩株菌的抑菌率在50%左右，雖然腐敗菌數(shù)目減少了一半，但是仍然存在較大數(shù)量的菌株，因此在表2中腐敗菌在液體中仍會出現(xiàn)長膜、沉淀、渾濁等現(xiàn)象。乳酸菌SCP53對菌株1P-1和4P-2的抑菌率分別為88.24%和76.47%，是三株乳酸菌中抑制酵母菌效果最好的菌株，在表2中也只是在1P-1試管中出現(xiàn)輕微長膜的現(xiàn)象，但是由于仍有部分菌體殘留，所以液體仍然具有一定的渾濁度。因此酵母菌的數(shù)量對泡菜樣品是否產(chǎn)膜以及渾濁度具有較高的相關性，數(shù)量越高，生花的程度以及液體的渾濁度越嚴重。

2.3 乳酸菌在泡菜發(fā)酵過程中的抑菌效果測定結果與分析

為了進一步驗證SCP53對腐敗菌在泡菜發(fā)酵過程中的抑菌效果，將其與腐敗菌共同接種用于蘿卜泡菜的發(fā)酵。從圖1中可以直觀的看出，第一排只接種腐敗菌的樣品均出現(xiàn)不同程度的長膜、汁液渾濁、顏色劣變現(xiàn)象。從成膜的現(xiàn)象來看，接種1P-1菌株的泡菜樣品表現(xiàn)出了嚴重的生花情況，發(fā)酵液表面出現(xiàn)一層厚厚的皺褶膜，泡菜汁液變渾濁，其次為4P-2表面一層明顯的白膜，泡蘿卜顏色變白，汁液也較渾濁。3P-1有零星的明顯的膜，泡菜顏色褐變。1P-2接種的樣品顏色正常，但是也出現(xiàn)零星的生花現(xiàn)象。而下排與乳酸菌SCP53共同接種以后，泡菜品質(zhì)均得到改善。生花最嚴重的1P-1產(chǎn)膜的現(xiàn)象得到明顯控制，只出現(xiàn)零星的膜，顏色也得到較大改善；接種4P-2的樣品生花現(xiàn)象得到控制，湯汁較清亮；接種3P-1的樣品雖然仍存在褐變的現(xiàn)象，但是無生花和湯汁渾濁的情況。而對于接種1P-2的樣品，不良現(xiàn)象幾乎都被全部抑制，泡菜顏色非常鮮亮，湯汁澄清透明。結果表明：乳酸菌SCP53接種于發(fā)酵泡菜中能較好地抑制泡菜中生花腐敗菌的生長，可單獨或配合其他乳酸菌用于直投式泡菜菌種的制作。

圖1 在泡蘿卜中乳酸菌SCP53對腐敗菌的抑制效果Fig.1 The inhibition of SCP53 to spoilage microorganism in radish pickle

表2 乳酸菌對腐敗菌在液體條件下生長的抑制效果Table 2 The inhibiton of lactic acid bacteria to spoilage microorganisms in liquid

表3 添加不同乳酸菌上清液對腐敗菌的抑制率測定結果Table 3 Inhibition rate of LAB supernatant fluid to spoilage microorganisms

3 討論

由于生產(chǎn)泡菜的蔬菜原料通常不會通過滅菌處理，因此泡菜經(jīng)發(fā)酵后殘留的腐敗微生物在合適的條件下就容易出現(xiàn)生花、顏色退變、變軟等腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象[8]。篩選具有針對性抑菌能力的乳酸菌用于泡菜菌種的制作對發(fā)酵型泡菜的品質(zhì)保證具有較好的作用。

筆者在論文的實施過程中并沒有采用直接將乳酸菌和腐敗菌接種到泡菜中的方式來觀察實驗結果，主要目的是為了排除原料中帶有的微生物對實驗結果的影響。通過平板和試管中的結果來進行篩選，結果更加準確。

供試的乳酸菌中有5株均為植物乳桿菌，菌株在產(chǎn)酸能力上并不存在太大的差異，而只有SCP53表現(xiàn)出了明顯的抑制酵母菌生長代謝的能力，說明該菌株的代謝產(chǎn)物中可能含有細菌素類物質(zhì)，在后續(xù)實驗中我們將對其進行驗證。

對接種乳酸菌和腐敗微生物發(fā)酵的泡菜樣品進行結果觀察時，主要針對生花、顏色以及湯汁的渾濁程度來進行了驗證。本應該對泡菜樣品進行品嘗，分析其對滋氣味的變化，但是由于接種了一定量的腐敗菌，出于安全的考慮未進行分析。后續(xù)我們還將通過質(zhì)構儀、氣相色譜、電子鼻等設備對接種腐敗菌以及接種SCP53后對泡菜的質(zhì)構及滋氣味的變化進行進一步的分析和討論。

4 結論

通過對比不同乳酸菌上清液對四株腐敗菌在平板以及發(fā)酵液中的抑菌效果，篩選出對供試腐敗菌都具有較強抑制作用的乳酸菌SCP53用于與腐敗菌共同接種發(fā)酵蘿卜泡菜。通過與只接種腐敗菌的樣品相比，菌株SCP53能有效抑制腐敗菌產(chǎn)膜、變色、使汁液渾濁等現(xiàn)象，可用于直投式泡菜菌種的開發(fā)。

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Screening Lactobacillus to inhibit spoilage microorganism isolated from film-forming pickle

AO Xiao-lin1，PU Biao1，CAI Yi-min2，CHEN Cen1，HU Ai-hua1，CHEN An-jun1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625000，China；2.Japan International Research Center for Agricultural Sciences（JIRCAS），Ibaraki 305-8686，Japan）

Seven lactic acid bacteria strains isolated from high-quality pickle samples were screened to inhibit four kinds of spoilage microorganisms，which caused the pickle film.Lactobacillus plantarum SCP53，which had strong antimicrobial activity to tested spoilage microorganisms，was selected by oxford cup method and liquid culture（film，precipitation，liquid turbidity，and inhibition rate to spoilage microorganisms）.SCP53 and spoilage microorganisms were inoculated to make radish pickle，and the results indicated that SCP53 could prevent the formation of film and improved the quality of pickle.

pickle；lactic acid bacteria；spoilage microorganism；antimicrobial activity；screening

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0234-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.043

2014－03－25

敖曉琳（1979-），女，博士，講師，研究方向：食品微生物與生物技術。

國家自然科學基金項目（31171726）；四川省科技支撐計劃項目（2012NZ0002）。